单位学习计划范文
时间：2023-03-03 15:56:02
引言：寻求写作上的突破？我们特意为您精选了12篇单位学习计划范文，希望这些范文能够成为您写作时的参考，帮助您的文章更加丰富和深入。
篇1
一、公司安全教育培训计划管理人员
1.安全教育培训内容：建筑企业安全生产法规、政策，安全生产发展新动向，安全生产意识教育。
2.安全教育培训方法：内部强化培训、参加主管组织的培训。
3.安全教育培训：内部强化培训安排在年初、年末的空闲。主管培训要求按时参加。
4.培训地点：公司会议室
5.安全教育培训计划目的：强化安全生产意识，安全管理，搞好安全生产。
二、项目经理
1.安全教育培训计划内容：建筑企业安全生产法规、政策，项目安全管理制度，施工安全检查标准，安全生产发展新动向，潜在的危险因素及防范措施，安全生产意识教育。
2.安全教育培训计划方法：内部强化培训、参加主管组织的培训。
3.安全教育培训：内部强化培训安排在年初、年末的空闲。主管培训要求按时参加。
4.培训地点：公司会议室
5.安全教育培训计划目的：强化安全生产意识，安全管理，搞好安全生产。
三、安全员
1.安全教育培训计划内容：建筑企业安全生产法规、政策，公司安全管理制度，施工安全检查标准，安全生产发展新动向，安全技术技能培训，潜在的危险因素及防范措施，安全生产意识教育。
2.安全教育培训计划方法：内部强化培训、参加主管组织的培训。
3.安全教育培训：内部强化培训安排在年初年末的空闲及安全生产月期间。主管组织的培训要求按时参加。
4.培训地点：公司会议室
5.安全教育培训目的：强化安全生产意识，安全管理，搞好安全生产。
四、特殊工种、技岗人员。
1.安全教育培训内容：公司安全管理制度，安全生产常识，施工安全技术操作规程，安全技术技能培训，潜在的危险因素及防范措施，安全生产意识教育。
2.安全教育培训方法：内部强化培训。
3.安全教育培训：内部强化培训在建工程进度安排，每个工程培训次数不少于2次。
4.培训地点：工程所在地会议室
5.安全教育培训目的：强化安全生产和保护他人意识，安全操作技能，搞好安全生产。
五、教育培训计划实施措施：
篇2
5C学习框架正是在遵循结构化面试本质规律基础上，结合体验式教学模式特点而进行的学习设计。5c学习框架主要内容是概念形成(Conceptualize)、获取(Capture)、交流(Communicate)、思考(Consider)、巩固(Consolidate)这5个学习步骤，旨在指导考生如何通过自我学习，实现内化知识，形成能力的学习过程。
拓展阅读
在事业单位考试中，对广大考生来说，面试决定成败。考生大多因为在这一关，开始紧张、不自信起来。如何在千军万马中斩获鳌头，映入考官眼帘呢，下面是应届毕业生网给大家带来的一些关于事业单位面试的必备技巧。
第一，稳健、自信、懂礼仪
在面试过程中，考生面对陌生的环境、严肃的考官、生疏的题目，大部分人会有不自信的感觉，最关键的就是让考官想听你答题。考生平时应多注重心理暗示，在候考期间清除杂念，可在此过程中梳理答题思路和注意事项;进入考场前深呼吸，做到行为自然，语言神态自信，举止有礼貌;面带笑容的答题，目光柔和，与考官有自然交流，语言抑扬顿挫，重点突出，增强第一好感。
第二，娓娓道来不啰嗦
篇3
在以市场经济为主体的经济发展模式下，我国的市场经济制度不断完善，这也使得在事业单位中对财务管理工作以及相关工作人员的要求越来越高。但是在事业单位中，传统的粗放式的财务管理仍然存在，导致单位原有的财务管理模式的不适应性和滞后性越来越突出。改革和完善事业单位的财务管理制度，使其达到科学化、精细化已亟不可待。
一、事业单位财务管理科学化、精细化的基本概念
科学化是指在企业原有的管理模式的基础上，结合事业单位自身的性质和特点，引进先进的财务管理理念及模式，建立科学化、现代化的财务管理体系；精细化是指精益求精、精确定位、明确职责、求真务实，完善的财务管理制度和考核评价机制必须通过专业化、系统化、信息化的管理模式来建立，改变传统的粗放式的管理模式。总的来说，财务管理精细化是科学化实现的手段，财务管理科学化是精细化的目的。
财务管理有三个特征是比较明显的，一是专业化，专业化的管理人员和管理体制是财务管理精细化所需要的，只有专业了，才能够减小事业单位在管理工作中的阻力，才能够随机应变，让单位的利益尽量不受损；二是系统化，财务管理精细化是一项系统工程，牵扯众多内容并且环环相扣，任一个环节出现了问题，都会是整个管理工作出现偏颇，系统化的管理模式可以将整个的工作分为一个个小的环节，提高整个管理工作的效率；三是信息化，它是财务管理精细化的重要手段，只有将大量的数据管理量化，才能保证其科学性，避免经验主义。要想实现实现管理的的高效化、实时化和条理化，利用现代信息技术可以做到，因为它可以将海量的数据管理量化，提高管理要求，实现纸质管理向信息化的转变。
二、加强事业单位财务管理科学化、精细化的措施
（一）提高财务管理科学化、精细化的意识
观念很大程度上影响着人对事物的看法以及做法，因此要对事业单位的领导及其财务管理人员进行洗脑，消除他们政府大树下好乘凉的依赖心理，加强对他们灌输财务管理科学化、精细化的想法，转变传统的粗放式和经验式的管理观念，让财务管理真正的发挥作用。领导要在财务管理中以身作则并对员工灌输财务管理科学化、精细化的观念。对于那些没有把这些观念落实到实际行动中、甚至破坏阻碍了科学化、精细化管理的员工，要进行严厉的批评，而对于那些促进了财务管理科学化、精细化的员工给予奖励。同时，要提高财务人员的职业道德素养，向他们灌输主人翁意识，自发的维护单位利益，做好监督工作，真正的提高财务管理科学化、精细化。
（二）建立完善的内部控制机制
在事业单位中，完善的内部控制机制对进行财务管理科学化、精细化有巨大的帮助。具体问题具体分析，结合事业单位的实际情况，选择适当的方法建立内部控制体系，改善财务行为，使得每笔帐都清清楚楚。而且要让专门的部门对内部控制制度进行评价、分析，及时发现其中的问题，并加以改进和完善。
实行业务流程精细化，对工作的各个环节进行严格把控，尤其对于资金使用，更要严格按照规定来。明确各个工作环节的任务，根据实际情况进行系统管理，从而让各个环节相互协作 ，提高精细化管理。
（三）完善预算管理，提高预算精细化
预算管理在事业单位中是财务管理精细化非常重要的一环。事业单位在对项目进行投资建设时，一定要做好准备工作，让了解市场动态、调研市场、勘测施工场地等这样的变化因素都能在掌握之中，不打无准备之战。以此为依据进行成本预算并让专门的单位对预算结果进行审核，以确保得到一个精细、准确、科学的预算结果。
尽量让全员根据下年度的工作计划，结合业务的工作开展情况参与并共同讨论预算的编制，让预算深入基层，使预算体系能真正的反映各个部门的实际情况。对日常公用费用按人员测算人均定额，确保预算与实际情况相符。严格按照相关规定来执行预算过程，让预算真正的发挥作用。还要制定相关的预算执行考核制度并让预算执行结果与部门年度考核挂钩，使预算能真正的贯彻落实。
（四）让信息技术来提高财务管理现代化程度
利用现代信息技术手段，可以更好的提高财务管理科学化、精细化。如果事业单位利用信息技术手段对预算的执行进行事后记录，更能增加预算的科学性和准确性。还要想办法让单位的财务状况全程处于一种监督状态下，可以更高效合理的让单位财务运行。同时提高财务人员使用现代化技术手段的能力，让他们及时的掌握经济方面的信息，使财务管理科学化、精细化的水平更上一层楼。
三、结束语
总之，在市场经济制度越来越为完善的形势下，让财务管理达到科学化、精细化是事业单位体制改革必走的轨道。只有科学化、精细化了，事业单位的资金才能被高效的利用，才能发挥其最大的作用，才能提高财务管理工作的效率。只有这样，事业单位才能适应经济发展的趋势，才能促进社会的发展
参考文献：
篇4
一、引言
随着市场经济制度的不断完善，事业单位的内外部环境发生了显著变化，加上事业单位改革力度不断加大，出现了公共性事业单位与盈利性事业单位等不同的性质划分，原有的事业单位财务管理体制已不能适应新时代的需求，表现出明显的滞后性。为推动事业单位财务管理的改革与完善，国家出台新《事业单位会计准则》，对事业单位财务管理提出新的要求。在此背景下，有必要对事业单位的财务管理进行改革和创新，使财务管理更加科学化、精细化。
二、行政事业单位财务管理的精细化、科学化概述
1.行政事业单位财务管理的精细化、科学化的内涵
行政事业单位财务管理科学化主要是指按照科学的管理方式，在兼顾事业单位性质和特征的基础上，并将事业单位财务管理体系与现在的财务管理模式相结合，建立科学的事业单位财务管理体系。行政事业单位财务管理的精细化是指在财务管理过程中事业单位树立精益求精的思想和理念，使用专业化、数据化、系统化以及信息化的管理技术和方法，不断完善财务管理制度和评价机制，实现精确和精细的财务管理。行政事业单位财务管理的精细化与科学化密不可分，事业单位财务管理的科学化是财务管理精细化的目标，精细化是实现科学化的重要途径和手段。
2.行政事业单位财务管理精细化的体现
事业单位财务管理精细化主要体现在以下几个方面：（1）专业化，对于事业单位的财务管理工作应该由专门的财务人员进行管理，建立管理分工的专业化管理制度，这能够为事业单位财务管理工作精细化的实现提供重要的基础和前提条件。（2）系统化，财务管理工作涉及事业单位工作的方方面面，内容十分复杂，要提高财务管理工作的有效性以及精细化程度，就要将财务管理系统化。（3）数据化，数据是财务管理工作的直接对象和基础，只有将事业单位的各项活动通过数据资料来反映，才能有效管理和权衡财务工作。（4）信息化，信息技术的不断发展为财务管理工作提供了技术支持，加快财务管理工作的信息化水平已成为大势所趋，有利于进一步实现企业发展的科学化和精细化。
三、行政事业单位实现财务管理的精细化、科学化的重要性
1.精细化、科学化管理可以促进绩效政府的建立
《中华人民共和国国民经济和社会发展第十一个五年规划纲要》明确提出，要着力推进行政管理体制改革，加快建设服务政府、责任政府、法治政府。“十一五”规划为我国行政管理体制改革明确了方向，目前，政府职能转变不彻底，权责不明确、部门办事效率低下以及奢侈浪费现象普遍存在，建立决策科学、权责对等、分工合理、执行顺畅、监督有力的绩效型政府已经迫在眉睫。而只有加快实施精细化管理，才能有效提高行政效率，充分适应政府管理机能的转变。
2.精细化、科学化管理有利于提高国有资产的使用效益
当前事业单位国有资产使用效益较低，损失浪费现象严重。比如预算执行率不高、结余资金规模过大、固定资产管理混乱、资产配置不合理、对外投资效益低下等，需要尽快实施精细化管理，才能有效堵塞管理漏洞，夯实管理基础，精化管理环节，提高国有资产和国有资源的使用效益。
四、行政事业单位实现财务管理的精细化、科学化的措施
1.树立科学化和精细化管理的观念
思想观念决定着行为方式，事业单位要想实现财务管理工作的科学化和精细化，就必须要树立起科学化和精细化的管理理念。因此，事业单位的领导干部必须发挥带头的作用，积极学习财政部提出的财务管理科学化和精细化的各项要求，明确财务管理科学化和精细化的概念和内涵，将新准则运用于企业的实际工作中，加快实现事业单位财务管理工作的改革。加强科学化和精细化管理意识，对实现事业单位财务管理的科学化和精细化必不可少，也是至关重要的第一步。因此，事业单位的工作人员必须培养科学化和精细化的管理意识，不断提高工作人员的科学化和精细化管理水平，真正意义上促进财务管理工作的科学化和精细化的改革。
2.实施全面预算管理
预算管理是事业单位财务管理的重要组成部分，也是事业单位强化财务控制的有效手段。所以，事业单位应从预算编制、预算执行、预算分析、预算调整等方面着手，实施精细化预算管理。首先，科学编制事业单位预算。在预算编制之前，编制人员要深入各部门进行调查，了解和预测各部门的经费使用情况。在预算编制时，认真分析确定本单位的项目预算金额，对办公费、差旅费等日常公用费用按照人员测算人均定额，确保单位收支预算与实际情况相符。其次，强化预算执行控制。事业单位要以经批复的预算项目文本为依据，严格执行预算，重视预算事中、事后监督。再次，预算执行结果与部门年度考核挂钩，健全预算执行考核制度，明确考核指标、内容，并根据考核结果落实相应的奖惩措施。
3.固定资产核算科学化
现行《事业单位会计准则》规定：固定资产只核算账面价值，不计提折旧，通过“计提专用基金一一修购基金”对固定资产维护和修理进行账务处理。这就导致事业单位的资产负债表仅能反映固定资产原值，而无法体现固定资产价值的折损情况，易发生固定资产价值虚增。同时，事业单位将购置固定资产发生的费用全部列入当期支出，违背了收益性支出和资本性支出的划分原则，降低了会计信息的可靠性。因此，必须改进固定资产核算制度，实现固定资产核算科学化，保证会计报表的真实性。固定资产的科学化可以通过以下方面来进行，比如增设“累计折旧”会计科目，将其作为固定资产的抵减项目。
4.推动收入管理精细化
随着事业单位改革的逐渐深入，一些事业单位已经成为自收自支单位，虽然国家在事业单位改革当中，意图将这些事业单位改制成公共服务企业，但是从目前来看，这一改革目标的实现难度比较大。因此，当前在财务管理改革当中，要将收入管理精细化作为一项重要目标。这一方面，事业单位应该明确收入范围、项目的基础上，建立完善的收入台账，对所有收入进行分科目管理，所有收入要存入指定的管理账户，对资金按照国家事业单位收入分配要求进行统一的分配管理，事业单位对本年度内的收入没有支配权。另一方面，国家对于事业单位收入要采取国库集中支付，利用统一支付减少事业单位的收入管理权，避免成本支出与收入的混乱对财务管理的不良影响。
五、总结
总之，随着市场经济的不断发展，事业单位内外部环境发生了巨大变化，使得事业单位原有的财务管理模式已经难以适应事业单位改革发展的需要。为此，必须推动行政事业单位财务管理实现科学化、精细化管理阶段，不断改进和完善预算管理、成本核算、固定资产核算、收支管理等财务管理内容，从而提高事业单位财务管理工作效率和质量。
参考文献：
[1]杨国瑞.事业单位财务管理的科学化、精细化[J]. 中国广播电视学刊，2008，07：21-22.
[2]王雪莲.财政科学化精细化管理应用于事业单位财务管理的方法研究[J]. 国际商务财会，2012，11：39-41.
篇5
方法 选取高血压患者107例，根据颈动脉硬化情况分为内膜正常组?内膜
增厚组和斑块形成组，观察三组血Hcy，尿微量白蛋白与颈动脉彩色多普勒超声显像等?
结果 与内膜正常组比较，内膜增厚组和斑块形成组血清Hcy水平及尿微量
白蛋白量均增加，且斑块形成组比内膜增厚组显著增加，差异有统计学意义（P
?结论 血清Hcy水平和微量白蛋白尿联合检测可作为原发性高血压患者动
脉粥样硬化的筛选指标?
[关键词] 高血压；同型半胱氨酸；尿微量白蛋白；动脉粥样硬化
中图分类号：R544.1
文献标识码：A 文章编号：1009_816X
（2014）01_0041_02
doi：10.3969/j.issn.1009_816x.2014.01.16
近年来的研究表明血同型半胱氨酸（Hcy）与心血管疾病的关系密切，高Hcy血症被认为是动
脉粥样硬化的独立危险因素[1]?同时研究也表明，原发性高血压患者中微量白蛋
白尿可以用来预测与动脉粥样硬化相关的心血管事件的发生?发展，被认为是心血管疾病的
独立危险因素之一[2]?本文主要探讨原发性高血压患者血清Hcy及尿微量白蛋白与
颈动脉粥样硬化的关系?
1 资料与方法
1.1 一般资料：选取2010年7月至2012年6月我院住院及门诊就诊的原发性高血压患者107
例，根据颈动脉硬化情况分为内膜正常组?内膜增厚组和斑块形成组?内膜正常组33例，男
17
例，女16例；内膜增厚组37例，男19例，女18例；斑块形成组37例，男20例，女17例?高血
压
的诊断全部符合2010年中国高血压防治指南?排除标准：继发性高血压?心力衰竭?急性心
肌梗死?不稳定性心绞痛?感染性疾病?肿瘤?风湿性疾病?甲状腺疾病?肝肾功能不全等
?颈动脉粥样硬化诊断标准[3]：颈总动脉内膜-中层厚度（IMT）≥1.0mm为颈
动脉内膜增厚，IMT>1.3mm并有局部隆起者为斑块形成，颈动脉粥样硬化包括内膜增厚和斑
块形成?
1.2 方法：颈动脉IMT及动脉斑块的测定由我院专业B超室医师完成，使用美国GE730型彩
色多普勒超声仪，探头频率10mHz，定量测定颈动脉IMT及斑块形成情况?
实验室检查：患者禁食8～12小时后，次日清晨空腹抽取肘静脉血，测定甘油三酯（TG）?总
胆固醇（TC）?低密度脂蛋白胆固醇（LDL_C）?空腹血糖（FBG）?肌酐（Cr）?超敏C反应蛋白
（hs_CRP）等指标，用贝克曼DXC800全自动生化分析仪检测?用荧光生化法检测血Hcy的浓度
，正常值为5～15μmol/L?尿微量白蛋白测定：留取24小时尿，记录尿量，混匀后，留取标
本10ml送检，采用免疫放射比浊法，用美国BECKMAN ARRAY360 SYSTEM蛋白分析仪及配套试
剂检测?
1.3 统计学处理：数据采用SPSS 17.0版软件进行统计学处理，计量资料用（x
3 讨论
由于颈动脉位置表浅?易被体表超声检测，因此颈动脉IMT现已成为观察动脉硬化病变的一
个窗口，也是心脑血管病患病率和病死率的独立危险因素[3]，亦是高血压危险分
层中靶器官损害的主要指标之一[4，5]?近来越来越多的研究支持高Hcy血症是造
成和加速动脉粥样硬化的新的?重要独立危险因素，通常认为血Hcy升高程度能反映AS的进
展程度[6]?本研究资料显示，内膜增厚组和斑块形成组血清Hcy水平较内膜正常组
明显增加，且斑块形成组血清Hcy水平较内膜增厚组明显增加，提示Hcy参与高血压患者AS，
可用来反映AS严重程度?
微量白蛋白尿能促进动脉硬化的形成，是动脉硬化的早期表现，它被认为是心?脑?肾及血
管损伤的标志之一[7]?近年的研究发现原发性高血压可导致结缔组织增加和血管
平滑肌细胞增生肥大，而有微量白蛋白尿的患者内皮功能的改变会导致血管通透性的增加，
从而导致脂质进入血管壁，最终促进动脉粥样硬化的发生发展[2]?本文结果显示
：在原发性高血压患者中，与内膜正常组比较，内膜增厚组和斑块形成组尿微量白蛋白量均
增加，且斑块形成组与内膜增厚组相比，尿微量白蛋白量亦增加，高尿微量白蛋白显著增加
颈动脉粥样硬化的发生风险，提示微量白蛋白尿与颈动脉粥样硬化有关，而且随着颈动脉动
脉粥样硬化程度加重，微量白蛋白尿增高，说明微量白蛋白尿与动脉粥样硬化程度有相关性
?此外，亦有研究表明CRP不仅可以预测动脉粥样硬化，而且还直接参与动脉粥样硬化的形
成[8]?本文研究亦发现，hs_CRP显著增加颈动脉粥样硬化的发生风险?
总之，对于原发性高血压患者，血清Hcy水平和微量白蛋白尿检测可作为动脉粥样硬化的筛
选指标，对于高血压患者合并动脉粥样硬化的早期诊断有参考价值?
参考文献
[1]王俊，钱钧，许萍萍.高同型半胱氨酸血症致动脉粥样硬化的发病机制及血浆
浓度影响因素[J].内蒙古中医药，2012，31（21）：119-121.
[2]Jay PG， G eoge LB. Microalbuminuria marker of vascular dys function， risk
factor for cardiovascular disease[J]. Vascular medcine，2002，7（2）：35-43.
[3]何文.颈动脉彩色多普勒超声与临床[M].北京：科学技术文献出版社，2007：11.
[4]Ghiadoni L， Taddei S， Virdos A， et al. Endothelial function and commom c
arotid artery wall thickening in patients with essential hypertension[J]. Hype
rtension，1998，32（7）：25-32.
[5]许先进，董旭.颈动脉内膜中层厚度的临床研究进展[J].中国动脉硬化杂志，2008，
16（8）：665-668.
[6]薄涛.高同型半胱氨酸血症与高血压及冠心病相关分析[J].慢性病学杂志，2010，12
（5）：425-426.
[7]Klaus K， Knut BJ， Bo FR， et al. Very low level of microalbuminuria are
associated with increased risk of coronary heart disease and death independently
of renal function， hypertension and diabetes[J]. Circulation，2004，110（19）
篇6
一、基层行政事业单位实施预算管理精细化的重要性和必要性
提高预算管理科学化、精细化，有利于推动事业单位全面进入精细化管理阶段，精细化管理有助于事业单位财务目标的实现，对行政事业单位自身长远发展有着推动意义。
1、重要性
预算管理精细化有助于推动事业单位内部的科学化管理实施，促使事业单位财政分配公开透明，各岗位人员权责明确，科学、公正的决策机制，完善单位内部管理，促使社会资源得到充分利用。科学化精细化财务预算管理体制，促进公众对事业单位的监督意识增强，建立官员问责约束机制，形成事业单位市场化运作管理模式，推动单位健康可持续发展。
2、必要性
预算管理精细化是社会主义市场经济体制的客观要求，预算管理体系的科学化、精细化能够最大限度地促进事业单位实现资源的优化配置，加强财务预算管理效率的提升。同时，基层行政事业单位定位于服务社会、服务大众的社会目标。加强行政事业单位财务预算管理，建立健全财务预算管理体系，从预算管理科学化精细化的角度着手推动，更能发挥预算精细化所带来的社会效益，从长期来看，科学化、精细化的预算管理也是财政管理高效的内在要求。
二、对全面预算管理精细化的认识
1、全员、全面、全过程
全面预算管理是以单位年度业务计划为基础进行编制的，单位要求各部门各岗位结合岗位职能编制年度工作计划、结合工作计划编制岗位的业务预算编制，最后结合各部门预算编制汇总得到单位的年度预算计划。一方面，这种自下而上、全员覆盖的预算编制办法，使全员参与到各岗位预算编制过程，从而对本岗位的职能定位、工作计划和工作经费有了更清晰的认识，同时，也使得单位的预算编制符合实际业务开展的需要，有利于预算执行力度的提高。另一方面，全面预算管理体系要求预算编制需要考虑单位全部业务计划，考核各业务量和财务数据的合理性，在进行预算编制的同时，充分分析和完善各部门的预算编制科学性、合理性，必要时编制不同的预算数据供领导决策。
2、数据精准，符合实际需求
预算编制的每一个数据应力求精准，减少预算编制与执行的偏差，预算编制时的数据得到要有充分的市场预算分析，包括业务量、市场单价、市场走势预测等因素的考量；通过多种预算编制方法得到数据，尽量避免单一方法或历史经验来评估预算。确保预算数据尽可能准确，设立预算编制误差率控制在5%以内。
3、管理科学化、方式精细化
事业单位预算管理科目设置细化，实现会计科目与预算科目的无缝对接；这种预算科目设计方式有利于预算编制执行过程的监督和考核，预算执行的可追溯性强，从科目细化上保障了预算编制执行效率。预算模板中应着重增加对重点项目成本费用的专门预算，加强预算管理与业务的紧密性，细化预算管理方式，为预算管理的科学化、精细化奠定基础。同时，预算编制的科目细化与各岗位人员的绩效与预算执行情况挂钩，使得预算管理的责任细化到每一个员工身上，强化预算执行落实到实处。
三、编制精细化科学化预算的思路
1、财务工作理念的转变
随着事业单位财务改革的不断深入，财务预算管理理念也发生了较大的转变。行政事业单位要树立依法理财的法制观念，在单位中制定科学的预算管理、会计核算、资金流出和项目审计的管理制度，形成一套完整、科学、精细化的管理制度，使得财务管理工作能够有章可循。提高事业单位服务意识，加大对创新项目资金的投入和扶持，对资源进行优化配置，改善社会生活环境，提高基层行政事业单位的资金使用效率。
2、预算管理制度日趋完善
基层行政事业单位实施全面预算管理，其所涉及的各部门预算计划统一纳入到预算编制计划中，在编制预算过程中，需要细化预算所涉及的各个项目，科学合理地进行安排。对于业务部门的预算经费，对各项目的开支设定限额标准，同时规范经费申请的审批标准流程，超过部门预算的款项，通常情况下不给予拨款。项目经费集中支付，便于日常业务往来收支的统一管理，细化项目资金拨款及支付程序，规范日常预算执行过程，逐步建立起更加科学的财务预算管理制度。
3、不断提升财务监督能力
预算管理精细化工作需要各部门的支持和配合，建立监督约束机制，有助于预算管理人员管控各职能部门的财务收支情况。采购部门实施集中采购管理模式，促进物资采购过程的透明化、公开化；资产管理部门建立动态的管理制度，完善资产管理信息系统资料，保障资产数据真实性和可靠性。为了充分发挥财务预算管理的监督职能，加强事前、事中、事后的监督和控制，还需对企业的人员、资金、车辆等物资进行统一的编排和管理，加强对各项财务工作细节做到精细化；同时，还可以加强企业ERP系统的应用程度，促进预算管理精细化信息化。
四、提高预算管理科学化精细化的具体措施
1、深化内部控制，推动预算管理精细化
精细化预算管理制度是行政事业单位降本增效、完善内部成本考核机制、建立成本费用与业务绩效结合的有效衔接。探索行政事业单位内部控制与与预算管理有机结合的方法，为单位预算管理科学化精细化提高更加详实、准确、全面的基础信息。事业单位应充分重视内部控制与预算管理工作的结合，加强对收支情况的动态管理，部门预算的准确性直接关系到单位的财务经营情况，也涉及到各岗位人员的工作开展情况，结合内控制度实施预算管理，可以有效节约资金，提高财政资金使用效益，推动事业单位预算管理执行力度，确保各项工作的顺利开展。
2、预算支出制定定额标准，加强预算执行力
对于预算编制的精细化标准，需要每一个项目的资金支出都严格审核。财务预算部门需要制定会议费、办公耗材费、培训费等费用支出定额标准及要求，建立一套强有力的标准化规范化的费用标准管理体系，进而强化预算执行力。建立预算执行岗位责任制，用制度约束岗位预算的执行落实；完善内部控制机制对预算执行的监督职能，保证预算能够顺利实施。另外，预算管理可以借助现代化信息化手段，建立健全财务信息化管理系统，实现预算执行信息的实时反馈，在出现偏差时及时解决，降低资金使用风险，提高预算执行力度，严格管理和控制行政事业单位的预算外资金。
3、项目经费精细化，强化预算监督
在基层行政事业单位的项目经费管理中，需要建立完善的、科学的管理制度，确保项目经费精细化管理。在项目经费政策制定之后，需要结合行政事业单位的实际业务情况，具体落实项目精细化，保证项目经费管理度落实到项目执行中的各个环节。加强预算监督，保证预算的严肃性。财政部门、审计监察部门应加强对行政事业单位采购预算执行情况进行监督检查，发现问题及时反馈，要求事业单位进行整改，以达到预算管理的目标。事业单位的采购预算在未得到审批之前，严格禁止事业单位提前采购，否则不予报销。因此，只有建立起科学、精细化的预算管理监督机制才能保证预算管理的顺利执行。
4、推进预算绩效考核评价工作
要进行预算管理精细化，还需要优化预算管理绩效考核工作流程，通过制定标准化的工作规范和流程，将预算评价结果有效地应用于组织绩效考核环境，通过对预算执行结果的考核来评价预算执行效果，同时，便于掌握和了解后续业务开展所需的资金支持。预算绩效考核工作有利于岗位职责的细化和明确，加强财务成本费用与业务工作的挂钩，缩小预算编制与实际发生的费用之间的差距，从而加强对成本收支的管控。健全资产管理制度，编制资金优化预算方案，配合组织落实好资源优化配置审核工作，避免发生资金浪费、流失等现象。
5、加强工作人员预算管理意识，拓展科学化精细化管理思路
预算的编制与执行工作需要行政事业单位全员共同参与和完成，预算执行效果和效率直接关系到基层行政事业单位财务管理工作。因此，加强财务干部队伍的建设，推进全体员工对全面预算管理的认识和理解，尽可能多地创造机会和条件组织相关部门、人员学习预算管理培训，提高管理者的业务水平和综合素质。实施预算管理科学化精细化应该有专业素质较强的财务人才来做好相关工作，加强预算管理者的职业责任心，确保预算管理目标与组织战略目标一致性。部门间人员预算工作的交流沟通和实践操作能力，学习和借鉴其他单位的成功经验，不断提升财务工作人员素质。
五、结语
基层行政事业单位作为我国的公共服务部门，其财务预算管理的科学化精细化管理体系建设是十分必要的。一方面，行政事业单位有必要内部设立专门的预算管理人员和机构，负责预算的编制、组织、执行、监督、考核评价等工作；另一方面，定期对预算管理精细化工作进行复查，及时发现问题，强化预算执行力。坚持科学合理的发展思路，积极调动全体人员的预算管理意识，深化单位财务预算管理体系，进一步落实预算精细化科学化管理。因此，提高基层行政事业单位预算管理精细化、科学化，对于我国建立和完善社会主义市场经济体制具有非常重要的战略意义。
【参考文献】
篇7
【关键词】 围绝经期 性激素 血浆脂蛋白
妇女随着年龄增长，经历不同的生理阶段，体内性激素发生很大的变化，生理代谢系统也发生变化，各种疾病随之增多，尤其是冠心病等心脑血管疾病的发生率，绝经后明显增加。心血管流行病学研究表明，绝经后妇女的冠心病发生率和死亡率比绝经前高4～5倍［1］。为探讨女性激素变化对血脂代谢的影响，我们测定了76例绝经前期、围绝经期及绝经后妇女的性激素六项及血脂六项，了解性激素在冠心病等心脑血管疾病发病机制中的作用，现报告如下。
资料与方法
1.一般资料
76例妇女均无内分泌及心血管疾病史，无服降血脂及类固醇激素药物。根据生理阶段分组，绝经后期组32例(47～81岁)，绝经1～36年；围绝经期组17例(44～56岁)，既往月经规律，出现不规则月经或闭经＜1年；绝经前期组27例(20～51岁)，正常育龄行经妇女。
2.标本采集
所有研究对象均采用一次性真空采血管于清晨7～9时空腹抽取肘静脉血3 ml两管送检，2小时内分离血清，一管留本院检验科检测血浆脂蛋白，另一管送合作单位右江民族医学院核医学科检测性激素六项。绝经前期及围绝经期组有月经者选择月经后13天内采血，于冰箱冰冻保存，集中检测。
3.性激素六项检测方法
促卵泡生成素(FSH)、黄体生成素(LH)、泌乳素（PRL）、孕酮(P)、雌二醇(E2)、睾酮（T）采用化学发光法测定，使用由美国进口的贝克曼ACCESS2全自动化学发光免疫分析仪及配套试剂进行测定，各项目试剂盒质控正常，批内变异＜6.5%，批间变异＜9%。
4.血脂六项检测方法
血清总胆固醇(TCH)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)、载脂蛋白A1（apoA1）、载脂蛋白B（apoB）测定均采用氧化物酶终点法，低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)利用Friedwald公式LDLC=(TC1)/(5TGHDL) 计算。使用深圳迈瑞公司生产的BS300全自动生化分析仪及配套试剂进行测定，质控使用LANDOX质控血清，批内误差＜7.2%，批间误差＜9.8%。
5.统计学分析
计量资料以均数±标准差(-±s)表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为有显著性差异。
结果
1.性激素水平变化
围绝经期组与绝经前期组相比较E2水平有所下降，但两者差异无显著性(P＞0.05)；绝经后期E2水平显著低于绝经前期组及围绝经期组(P＜0.01)；绝经后期组与围绝经期组FSH和LH水平均显著高于绝经前期组(P＜0.01)，而绝经后期组较围绝经期组升高更明显，两者比较差异有显著性(P＜0.01)；围绝经期组与绝经前期组PRL和T水平相比较差异无显著性(P＞0.05)，绝经后期PRL和T水平明显低于绝经前期组及围绝经期组(P＜0.05)；而三组相比较P水平的差异均无显著性(P＞0.05)。各项检测结果见表1。表1 三组妇女性激素六项测定结果(略)注：与围绝经期组比较P＜0.01；与围绝经期组比较P＜0.05。
2.血脂水平变化
绝经后期组出现异常脂质改变，与围绝经期组及绝经前期组相比较TCH、TG、LDLC、apoB明显升高，HDLC明显下降（P均＜0.01）；apoA1下降不太明显（P＜0.05），而围绝经期与绝经前期组上述血脂水平相比较无显著性差异(P＞0.05)。各项检测结果见表2。表2 三组妇女性激素六项测定结果(略)注：与围绝经期组比较P＜0.01；与围绝经期组比较P＜0.05。
3.性激素与血脂的关系
经多元回归分析及线性相关分析结果显示，血浆脂蛋白的变化仅与六项性激素中E2有较明显的关系，E2与TCH、HDLC、LDLC、apoA1、apoB之间的相关系数(r)分别为-0.862、0.658、-0.791、0.573、0.526 (P均＜0.05) ，而与TG无相关性(r=0.174，P＞0.05)。
讨 论
1.本组资料结果显示：围绝经期妇女的FSH和LH水平明显高于绝经前期妇女，但E2水平则无显著性下降，提示此期妇女的卵巢合成和分泌雌激素的能力已降低，但卵巢细胞功能尚能代偿，经FSH和LH对卵巢细胞的作用加强后，使其合成和分泌能力代偿性增强，表现为血液中的雌激素浓度维持在正常水平，而绝经后期妇女雌激素水平显著低于前两期的妇女，FSH和LH水平显著增高，与妇女的生理变化相符［2］。
2.绝经期妇女由于卵巢功能逐渐衰退，合成和分泌卵巢激素的量也逐渐减少，从而使体内性激素之间的平衡发生了很大的变化，会引起许多生理功能紊乱，心、脑、血管病变增多和骨质疏松等问题［3］。流行病学资料表明，绝经后妇女冠心病(CHD)的发病率明显上升，绝经前期妇女CHD的发病率与同年龄组男性比较有明显的性别差异，约为1∶4，但绝经后期妇女的发病率却与男性趋于一致。研究表明［4］，脂代谢系统、糖代谢系统等的异常改变可引起CHD发病率增高，脂质的异常改变，主要表现为TCH、LDLC、apoB升高，HDLC、apoA1降低，这些变化成为绝经后妇女CHD发病率增多的原因之一。本研究结果显示绝经后妇女TCH、LDLC、apoB水平明显升高，HDLC降低，均与E2水平的降低有较强的相关性，也说明绝经后妇女雌激素水平下降是血脂代谢紊乱及CHD发病率增加的主要原因。
3.雌激素对心血管功能有保护作用［5］，表现在：①保护血管内皮系统，增加血管舒张因子的活性，具有舒张血管，改变微循环的功能；②阻断钙离子通道，调节血管平滑肌对α2肾上腺素的效应，增加前列腺素合成；③通过改善血管壁胶原和弹性蛋白比例，保持血管壁弹性；④参与BL代谢的调节。因此，雌激素从多个环节抑制粥样斑块的形成，降低斑块的脆性，减少斑块破裂、阻塞所引起的合并症，促进冠状血管侧支循环的建立，从而有效地保护了心血管系统的正常功能。研究结果表明［6～7］，给予绝经后妇女行雌激素替代治疗(ERT)可有效的防治CHD的发生，这为绝经后妇女的ERT提供了理论依据。
4.根据文献报道［8］，雌激素有调节血脂代谢的作用，绝经期接受雌激素替代治疗的妇女比未接受替代治疗者的冠心病发病率及死亡率降低50%～70%，由此可以看出，绝经期妇女血脂的异常改变与雌激素缺乏有明显关系，尤其是绝经后妇女E2水平严重降低可能导致脂代谢异常，是绝经后妇女发生冠心病的重要原因之一。因此，对于绝经期女性，尤其在已发生冠心病及有冠心病危险的高危人群，应用雌激素替代治疗可能会对绝经期女性心血管疾病的防治起重要的作用。
参考文献
［1］陆建建，许春平，曾 波，等.绝经后女性性激素、血脂变化与冠心病的研究［J］.中国老年学杂志，2006，26（4）:453-454.
［2］刘涵涛，林亚梅.围绝经期妇女性激素水平的变化［J］.现代保健·医学创新研究，2007，4（20）:139-140.
［3］王 颖，包 艳.绝经后性激素水平的变化与骨质疏松的关系［J］.武汉大学学报（医学版），2005，26（5）:660-661.
［4］布庆侠，徐 军，许玉霞.绝经女性脑血栓形成患者血Lp(a)与性激素的关系［J］.山东医药，2007，47（1）:40-40.
［5］李连香，陈亚琼.雌激素受体和绝经的研究进展［J］.国外医学·妇幼保健分册，2003，14（4）:214-216.
篇8
会计信息化规范预算编制流程，强化数据分析比较。会计信息化管理平台要求部门必须按照预算管理流程进行预算编制、调整、审核、审批和执行。以支定收，结合部门预算规划和科研实际需要，按照关键节点有计划地执行预算。会计信息化通过对各类支出结构的数据分析，强化了数据分析比较。例如：办公费、差旅费、三公经费等会计科目的人均支出对比。通过对预算的执行和调整、监控和分析、考核与评价，真正发挥预算管理的权威性和对经费保障的指导作用。
会计信息化实现了预算执行实时监控。根据上级主管部门的预算控制数，按照各个预算科目将基本支出（公用经费、人员经费）、各种经费来源的科研项目支出以及基建项目、修购项目等预算金额录入系统，设置预警功能。对经费执行过程进行实时监督，以防超预算开支、突破预算额度、预算科目之间调剂，有效控制项目执行部门挪用专项资金的情况发生。会计信息化管理平台，在预算执行的过程中，可以与科研管理系统实时交换、互动及依存信息，预算执行比例随时显示，方便上报。预算控制职能改由会计信息化系统自动完成，由人工监控向自动监控转变，一旦某项支出超过预算额度，系统将自动提示，同时向财务主管预警。
会计信息化管理平台可以将预算执行客观数据纳入年终考核体系，使预算考核从主观绩效评价转变为客观绩效评价。在会计信息化系统中，科学设计绩效评价指标， 运用正确方法进行考核评价，能够提高部门预算的科学性和合理性。加强预算管理的绩效考核，并以此为基础确定各部门的工作业绩，制定奖惩制度，并以考核评价结果作为以后年度预算安排的依据。通过对预算的执行率进行考核， 部门在编制下一年度预算时会着重考虑资金安排的科学性、合理性和效益性， 从而降低单位运行成本， 提高财政资金的使用效率。
二、会计信息化对财务审批控制的影响
（一）建立岗位责任制
系统维护人员根据财务业务中每个人角色的不同进行授权，设置不同的权限。
（二）建立内部审批制度
按照会计审核―项目负责人―财务主管―分管工作所领导―所长等管理环节，进行电子流转审批。
（三）规范网上报销流程，增加时效性
降低了对空间性和时间性的要求，解决了必须在指定时间、空间找领导签字的困扰。科研人员不必到处找领导签字，同时，领导也能够随时掌握部门的财务状况。通过会计信息化管理系统，科研人员可以在网上填写报销单，并通过局域网上传给分管领导，即使领导不在办公室，也能够依赖局域网突破时空限制，进行远程网上审批。
（四）大幅拓展管理幅度，是对办公自动化的补充手段
实现信息高度集成，使上级与基层之间可以更准确、更及时和更全面地实现信息沟通。用电子的手段较好地保留了上层领导的原始意见、审批流程、内部请示等环节，对办公自动化手段进行补充，大力相应国家无纸化办公的号召。
三、会计信息化对会计档案控制方面的影响
（1）加强会计电子档案与数据存储、备份管理，会计信息化建立了新的会计档案管理制度，不仅要保存纸质会计凭证，还要保存会计电子数据。
（2）会计信息化能够实时记录财务工作网上流程，并将其转变为可视的网上电子信息，供授权用户随时对会计档案进行查询、监督。审批后的纸质凭证经过加密扫描到会计信息化系统中，一经上传，不可删除，只可作废，财务审批由领导亲笔签名转变为电子签名，并将报销单据的电子信息和数字签名捆绑加密。
四、会计信息化对内部审计控制方面的影响
（一）财务工作实现可视化监控
会计信息化是一个高度集成、规范、统一的管理平台，它为各部门间的协同工作提供通畅的沟通机制。授权用户可以在任意时点登录会计信息化管理平台，实时查看待办事项的流转状态，待办事项已经经过哪几个环节，哪个环节出现了问题，目前在哪个节点等待审批。会计信息化使会计工作不再是一个孤岛，而是整个单位业务开展的枢纽。会计信息化不仅满足了财务管理的动态化需求，同时，它通过建造一个科学工作流引擎，来驱动跨部门的业务流程的运作。
（二）应用模式向持续在线审计转变，在线获取信息--实时分析--报告结论
数据可以被分为一般的业务常规数据和审计人员自定义的或根据专项检查特殊要求分出的非常规数据。会计信息化管理系统应用之前，很多内部审计项目需要依赖手工对帐表凭证和数据资料进行检查、计算、复核和分析，效率抵、时间长、准确性差、成本高。
五、会计信息化对决算评价控制方面的影响
篇9
【关键词】 复方丹参滴丸;骨髓间充质干细胞;心肌样细胞;分化;活血化瘀
传统观点认为心肌细胞不能再生，现在的治疗手段和措施通常不能防止左心室重构和心力衰竭的进程。目前认为干细胞可以重塑心肌细胞，有望可以替代坏死心肌组织。Tomita等〔1〕观察了自体骨髓基质细胞移植对大动物心肌再生的作用，结果提示移植细胞可形成岛样心肌细胞，促进血管新生，防止左室重塑，提高局部及全心的收缩功能。通过骨髓间充质干细胞(MSCs)心肌内移植，组织病理学和免疫组化的方法显示输入的干细胞可以分化为心肌样细胞，血管平滑肌细胞和内皮细胞〔2〕，而且能增加血管密度。活血化瘀类中药治疗缺血性心脏病有肯定的疗效，复方丹参滴丸具有抗心肌缺血、缺氧和扩张冠脉作用，临床主要用于治疗冠心病心绞痛。本研究旨在探讨活血化瘀中成药——复方丹参滴丸能否在体外干预大鼠MSCs分化为心肌样细胞，并为诠释活血化瘀类中药治疗缺血性心脏病机制提供动物实验依据。
1 材料与方法
1.1 试剂与器材
1.1.1 试剂 DMEM低糖培养基，胎牛血清，0.25%胰蛋白酶(含0.01%EDTA)均为Gibco公司产品，小鼠抗大鼠荧光标记抗体CD34PE(Santa Cruz)、CD106PE(Biolegend)，CD31FITC、D45FITC、CD90FITC(Serotec)，阴性对照：小鼠IgG1PE、小鼠IgG1FITC(Santa Cruz)。小鼠抗大鼠单克隆抗体sarcomeric α辅肌动蛋白(αActinin)、结蛋白(desmin)，肌球蛋白重链原位杂交试剂盒(天津灏洋生物制品科技有限公司)。
1.1.2 器材 CO2细胞培养箱(Thermo Forma)，H600透射电子显微镜(HITACHI)，流式细胞仪(Calibur，美国BectonDickinson公司)，6孔培养板，25 cm2、75 cm2塑料培养瓶(美国Corning公司)，倒置相差显微镜(Olympus)，Heraeus离心机(D37520，德国Osterode公司)。
1.1.3 实验动物 清洁级SD大鼠，雄性，由中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心提供，动物许可证号：scxk津20050001。
1.2 方法
1.2.1 骨髓MSCs的分离扩增 100～120 g雄性SD大鼠，颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡5～10 min，无菌条件下取大鼠股骨、胫骨，去除附着于骨表面的组织，去除股骨、胫骨的骨骺，用20 ml DMEM冲洗骨髓腔获取骨髓细胞，收集于离心管内，充分吹打制成细胞悬液，1 000 r/min，20℃离心10 min，收集细胞，用20 ml完全培养基(DMEM，20%FBS，青霉素G 100 U/ml、链霉素100 U/ml，谷氨酰胺0.2 mmol/L)重悬细胞，接种于75 cm2的塑料培养瓶中，全程置于5% CO2，37℃，饱和湿度的孵箱中静置培养。3～5 d首次换液，以后每隔3～4 d换液洗去未贴壁细胞，原代细胞铺满整个培养瓶底面的80%～90%时，用0.25%胰酶(含1%EDTA)按1∶3进行消化传代。
1.2.2 MSCs的表面抗原检测 取第四代骨髓MSCs，经0.25%胰酶(含1%EDTA)消化，PBS洗涤2～3次，经流式细胞仪检测细胞表面标记。
1.2.3 复方丹参滴丸含药血清制备 根据成人日服药量折算成大鼠灌胃剂量，计算大鼠日灌胃剂量54.34 mg/kg。将大鼠随机分为实验组和对照组。实验组每日予复方丹参滴丸含药血清灌胃，对照组予等体积蒸馏水灌胃，均连灌7 d。每日一次。最后1 d灌胃30 min后无菌条件下股动脉取血，3 000 r/min离心15 min，分离血清，56℃水浴灭活30 min，过滤除菌，-20℃短期保存备用，制备含药血清和空白对照血清。
1.2.4 复方丹参滴丸含药血清诱导MSCs 选生长状态良好的P4细胞，每孔以2×104个细胞的浓度接种于6孔培养板中，培养至细胞90%融合后分别诱导，加入含药血清，体积终浓度为20%，作用72 h后去除培养基继续培养，同时，设西药组：加入终浓度为5 μmol/L的5氮胞苷，预诱导24 h后去除培养基;中西药组：加入终浓度为5 μmol/L的5Aza，预诱导24 h后去除培养基，再与含药血清作用72 h去除培养基，继续培养;空白组：加入空白对照血清，体积终浓度为20%，72 h后去处培养基，继续培养。倒置相差显微镜下观察7～21 d细胞形态变化，进行免疫组化、电镜检测。
1.2.5 免疫细胞化学染色 诱导后的细胞，用4%多聚甲醛室温固定2 h，洗涤后，阻断内源性过氧化物酶，分别滴加1抗αActinin、desmin，4℃过夜，加生物素化兔抗小鼠IgG1第二抗体，37℃ 45 min，PBS 液冲洗3 次，DAB 显色，自来水冲洗，苏木素复染5～10 min。PBS洗涤蓝化后，蒸馏水冲洗两次后，37℃空干后，70%甘油封片。以不加一抗作为阴性对照。
1.2.6 透射电镜观察 诱导后的细胞经2.5%戊二醛固定，制成电镜标本，透射电镜下观察细胞形态结构。
1.2.7 原位杂交组织化学 将诱导培养的细胞，PBS 冲洗3次，4%多聚甲醛室温固定2 h，加打孔液于细胞培养孔内，封闭内源性过氧化氢酶，PBS洗3次，滴加预杂交工作液和含探针的杂交工作液洗涤后，DAB显色，苏木素复染，细胞质显棕黄色颗粒为阳性反应，70%甘油封片，镜下观察。肌球蛋白重链探针序列：5′GATAGGCGTTGTCAGAGATGGAGAAGAT。
2 结 果
2.1 细胞形态学观察及表面标志 新鲜制备骨髓细胞悬液可见大量悬浮红细胞，24 h后部分细胞贴壁生长，开始为均一的单个圆形，10～14 d后细胞基本长满瓶底，细胞呈旋涡状生长，细胞为均匀一致的长梭形，胞体中央膨大为扁圆形的细胞核，可见1～3个核仁传代后，细胞变为形态均一的排列有序的成纤维细胞样，长梭形，胞浆突起较少，胞体轮廓不甚清晰，胞体也相对较大。流式细胞仪检测结果提示，大鼠MSCs表达CD90，CD106，但是CD45、CD34和CD31表达阴性。诱导后空白组的细胞形态无显著变化，经过5氮胞苷、复方丹参滴丸含药血清作用后，细胞形态逐渐发生改变。7 d后，大约30%～40%MSCs大小逐渐增加，表现为球形，或者在一个方向上逐渐加长，形成类似于棍棒样形状。14 d后毗邻的细胞互相连接，排列方向渐趋一致，分别经过5氮胞苷、复方丹参含药血清及二者共同作用的细胞部分发生溶解，21 d时可见形成肌管样结构，可见单个核仁，位于细胞的中部。见图1。
2.2 诱导细胞的免疫化学鉴定 经复方丹参滴丸含药血清作用21 d后，部分细胞表达αactinin和desmin，出现较强阳性表现，其阳性强于西药组和中西药组的细胞。
2.3 透射电镜观察 经复方丹参滴丸含药血清诱导后的细胞除胶原蛋白颗粒外，胞浆中可见肌原纤维或肌丝束，密度高低不一，细胞兼有间质细胞和肌细胞特点。见图1。
2.4 诱导细胞的原位杂交化学分析 经复方丹参滴丸含药血清作用21 d后，部分细胞表达肌球蛋白重链，出现较强阳性表现，其阳性强于西药组和中西药组的细胞。见图1。图1 各类MSCs
3 讨 论
成体骨髓内包括两种骨髓干细胞：造血干细胞，能产生血液系统所有成熟的谱系;MSCs有时称作基质细胞。MSCs协助骨髓造血干细胞的增殖分化，参与构成造血干细胞的生存和分化环境，对造血干细胞起支持作用〔3〕，具有自我更新和分化为多重谱系的能力，在适当条件刺激下，在体内、体外能够分化为骨、脂肪、软骨〔4，5〕，在体外还可以分化成肌肉组织〔6〕。
MSCs在体外和体内可以分化成心肌细胞，这些可以从细胞的形态学、自发性搏动或者特殊肌蛋白表达进行鉴定〔7〕，骨髓间充质细胞在体外诱导1 w后细胞间形成肌管样结构连接，3 w后表达肌球蛋白、结蛋白、辅肌动蛋白，具有心肌细胞超微结构特征〔7〕。复方丹参滴丸是常用的活血化瘀中成药，是在现代高科技条件下提取丹参、三七的有效成分再加入适量冰片而制成的新型纯中药滴丸剂，其主要成分是丹参、三七、冰片。丹参具有活血化瘀之功效，三七活血化瘀止痛，冰片芳香通窍，活血散结，三药合用共奏活血化瘀、通络止痛之功效，主要用于瘀血阻滞引起的缺血性心脏病的治疗。复方丹参滴丸为速效制剂，其中的丹参素、原儿茶醛、三七皂甙均为水溶性，可直接经黏膜吸收入血、生物利用度及疗效高、无胃肠刺激、无明显毒副作用的特点〔8〕。现代药理研究表明:复方丹参滴丸具有扩张冠状血管，增加冠脉血流量，抑制血小板聚集，降低血脂，调节血液黏稠度，改善微循环，改善心肌缺血缺氧的作用。三七的有效提取成分〔9〕能够诱导大鼠MSCs分化为心肌样细胞，表达Desmin、肌钙蛋白、MHC，叶氏等〔10〕应用双龙方的含药血清干预小型MSCs分化为心肌样细胞，发现蛋白的表达差异可能同中药干预有关。本实验中经过复方丹参滴丸含药血清诱导的细胞部分强阳性表达αActinin、desmin、人肾小球系膜细胞(MHC)，电子显微镜下发现细胞胞浆中可见肌原纤维或肌丝束，具有心肌样细胞的特征。空白组则不表达三种蛋白，中西药组和西药组均弱表达αActinin、desmin、MHC，这也提示药物的过多应用不会对疾病的治疗提供肯定的疗效。
本研究采用了血清药理学的方法，从体外模拟体内药物与细胞相互作用的微环境，初步探讨复方丹参滴丸在体外对干细胞定向诱导分化为心肌样细胞的作用，结果表明活血化瘀类中药复方制剂复方丹参滴丸对促进MSCs修复缺血心肌有重要的应用价值，初步为诠释复方丹参滴丸治疗缺血性心脏病的机制提供了干细胞层次实验依据。
参考文献
1 Tomita S，Mickle DA，Weisel RD，et al.Improved heart function with myogensis and angiogenesis after autologous porcine bone marrow stromal cell transplantation〔J〕.J Thorac Cardiovasc Surg，2002;123(6):113240.
2 Gojo S，Gojo N，Takeda Y，et al.In vivo cardiovasculogenesis by direct injection of isolated adult mesenchymal stem cells〔J〕.Exp Cell Res，2003;288(1):519.
3 Prockop DJ.Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues〔J〕.Science，1997;276(5309)：714.
4 Pereira RF，O′Hara MD，Laptev AV，et al.Marrow stromal cells as a source of progenitor cells for nonhematopoietic tissues in transgenic mice with a phenotype of osteogenesis imperfecta〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1998;95(3):11427.
5 Clark B，Keating A.Biology of bone marrow stroma〔J〕.Ann NY Acad Sci，1995;770(1):708.
6 Wakitani S，Saito T，Caplan A.Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5azacytidine〔J〕.Muscle Nerve，1995;18(12):141726.
7 Makino S，Fukuda K，Miyoshi S，et al.Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro〔J〕.J Clin Invest，1999;103(15):697705.
篇10
关键词：脐血单个核细胞；神经干细胞；诱导分化；巢蛋白：致瘤性
中图分类号：R741
干细胞是指具有自我更新与多向分化潜能的细胞，它们在细胞疗法、基因治疗、发育学研究、药理及毒理学等研究中己显示出无可比拟的作用和优越性。近年来，神经干细胞fneural stem eells,NSCs)移植治疗中枢神经系统疾病引起人们的普遍关注，在动物实验中获得了较好的疗效，NSCs被认为是治疗神经系统疾病的良好载体。但是，由于来源的局限，NSCs的应用受到限制。成体干细胞是存在于发育成熟个体组织中的可自我更新和分化为原组织所有细胞类型的未分化细胞。根据其发育潜能可分为全能干细胞、多胚层多能干细胞、单胚层多能干细胞和定向专能干细胞。存在于骨髓基质中的间质干细胞(mesenehymal stem cdls,MSCs)是研究最早和最为深入的一类多能干细胞，其来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有广泛的分化潜能，已经有多项研究显示，外源骨髓MSCs移植入脑内，可以分化为神经细胞。表达神经元特异性标志蛋白。因为脐带血来源的MSCs和骨髓MScs有极其一致的生物学特性，且易于采集、制备及保存。免疫反应性低，因此可能更易于在临床上使用。本研究结合密度梯度离心和体外贴壁生长的方法得到脐血MSCs，诱导后检测其NSCs标志物Nesfin及Musashi-I的表达情况，并将培养后的脐血MSCs接种于裸鼠皮下，观察脐血MSCs对裸鼠的致瘤性，为应用于组织及其功能修复中提高该细胞的生物安全性提供新的依据。
1．材料和方法
1．1主垂试剂
高糖IMDM培养基(Gibco公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；淋巴细胞分层液(Cibco公司)；RNA提取试剂Tfizol(invit-rogen公司)；氯仿、异丙醇为国产分析纯试剂；DEPC水(sigma公司)；RT-PCR试剂盒(大连宝生物公司)；琼脂糖(sigma公司)。
1．2实验方法
1．2．1脐血间质干细胞的体外分离和扩增培养无菌条件下采集健康产妇足月妊娠顺产或剖腹产的婴儿脐带血50～100md肝素抗凝，与0.01moL/pH7.4的PBS按1:1混匀，再与3％的明胶1:1混匀，静置60min沉降红细胞。吸上清离心，弃上清，用PBS制成单细胞悬液，叠加到相对密度1.077的淋巴细胞分离液上，2000dr/min离心20min，取界面层，加PBS制成单细胞悬液，离心洗涤3次，弃上清。所得细胞以1.0x102／cm2(T-25培养瓶)的密度接种于含有15％胎牛血清的IMDM培养液(Hyclone公司，置于37℃、体积分数为5％的cm2、饱和湿度的孵箱内培养，3d后换液，弃去悬浮细胞，贴壁细胞继续培养，用倒置显微镜观察细胞形态的改变并照相。待细胞长到80％融合时，用2.5g/L的胰蛋白酶消化后传代。
收集分离后1h、培养后36、48、72h和5d的细胞，离心洗涤，在显微镜下，台盼蓝染色、计数，调整细胞密度备用。
1．2．2流式细胞仪检测取扩增一代的脐血间质干细胞，PBS洗涤后用2．5 WE的胰蛋白酶消化后制成1:0x106的单细胞悬液，共7管，1号管和2号管为阴性对照，分别加入抗鼠的IgG-FITC和IgG-PE单克隆抗体各5ml，其余5管分别加入抗人的CD34-PE，CD31-FITC，CDl3-PE，CD29-PE，CD44单抗各5m1．室温下孵育20min，流式细胞仪检测。
1．2．3脐血间质干细胞的诱导分化取原代细胞，加入20ng/m1 NGF和RA联合诱导培养，收集诱导前，诱导后36、48、72 h、5d的细胞，调整细胞密度备用。
1．2．4 RNA提取取诱导前，诱导后36、48、72h、5d的细胞各3x106个，融于1 mlTRIZOL试剂中，用吸管反复吹打后室温下孵育5min。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡后室温下10min。4℃，12000r/min离心15min后将上层无色液体移入新的EP管中。加入异丙醇，室温下放置10min，4℃，12000r/min离心10min弃去上清。加入75％乙醇，4℃，7500r/min离心5min，弃去上清液，风干，加入DEPC处理的纯净水40μl溶解后，55℃孵育15min。
1．2．5 RT-PCR采用相关软件设计引物，并由赛百盛生物工程公司合成。Nestin上游引物：5TCCTTTGACTTrCCTTGTC―TACCTCC 3，下游引物：5AAATCTGAAACTCAAGCACCA3：Musashi-l上游引物5TAATTCCTGTCCAGCAGTCTC3：下游引物5GAACCATCCCGTCCTGTATCAT3。对所提RNA进行定量，取1μgRNA转录成cDNA，在EP管中先后加入MgCL2×PCR buffer 1μl，RNase free H2O 3.75μl，dNTP lμ，RNase inhibor0.25μl，AMV逆转录酶0.5μl，oli-．go-dT接头引物0.5μl，RNA样品1μg，按照如下条件进行逆转录反应30℃10min，48℃50min，99℃5min，50℃5min。合成的cDNA进行PCR扩增。在EP管中依次加入下列物质：Taq酶0.25μl，10xPCR buffer10μl，纯净水27.75μl，
特异性上下游引物各0.5μl。内对照GAPDH上下游引物各0.5μl(30 μmol/L)，cDNA产物10μl，按照以下条件进行PCR反应。94℃预变性5min，94℃30s，57℃30s，72℃30s，30个循环后，72℃延伸7min。取5μlPCR扩增产物加样至含溴化乙锭(EB)20g/l的琼脂糖凝胶中，在5V/cm下电泳60min，紫外透视仪下观察结果，并用凝胶扫描成像系统照相，PCR定量分析软件进行分析。
1．2．6致瘤性取18只BALB/C裸鼠，随机分为3组，背部皮下组、颈部皮下组、对照组各6只。收集培养7d的MSCs，用PBS重悬并调整细胞密度为1x107/ml，非麻醉状态下，于裸鼠背部及颈部皮下分别无菌注射细胞悬液0.5ml，每只各4点．注入生理盐水作为对照组。定期观察，于3d、2周和8周取材，制作冰冻切片，HE染色，镜下观察。之后继续观察裸鼠生长情况至12周。
1．3统计学方法
数据以x＋s表示。采用SPSSl2.0软件对数据进行重复测量数据的分析，显著性水准取α=0.05。
2．结果
2．1脐血单个核细胞体外分离、培养后形态改变
培养前，脐血单个核细胞胞体较小，呈大小均一的圆形，直径约17μm，颜色较深，住高倍镜下可见其不停振动；培养后，细胞胞体增大，有破骨样细胞和梭形细胞两种形态。破骨样细胞胞体较大，呈圆形，多个核。梭形细胞大小不等。形态类似于骨髓MSCs，但较骨髓MSCs稍小。随着时间的推移，破骨样细胞减少而梭形细胞增多，即所需要的间质干细胞
2．2脐血干细胞的鉴定
流式细胞仪检测显示，扩增后的脐血MSCs既不表达造血干细胞的特异性表面标志CD34，也不表达内皮细胞的表面标志CD31，而CD29，CDl3，CD44等间质干细胞的表面标志均为阳性。这表明脐血MSCs是脐血中一群区别于造血细胞的处于未分化状态的非定向干细胞。
2．3诱导后NSCs标志物的表达
Nestin和Musashi-1作为NSCs的标志物已经得到广泛应用。通过RT-PCR检测诱导后这两个基因的表达，使用PCR定量分析软件，分析各样本的PCR光密度。将各样本的PCR光密度值除以内参GAPDH的PCR平均光密度值，重复测量5次。结果发现Nestin RNA在诱导前细胞中低表达，诱导后36h逐渐升高(p＜0.05)，72h后开始降低(p＜0.05)：Musashi-1RNA在诱导前细胞中低表达，诱导后48h呈高表达(P＜0.05)。
2．4致瘤性
于注射后3d、2周和8周取材，肉眼观察裸鼠背部无明显增生物形成。组织学观察接种3d局部有细胞团块存在，团块中心细胞部分坏死。2周时，细胞团块不明显，大部分细胞被吸收。8周时，接种区组织结构与未接种区无明显区别。裸鼠存活12周以上，未见有肿瘤形成。与对照组比较，生长情况与皮肤状况无明显差别。
3．讨论
NSCs具有自我更新和多分化潜能，为神经系统疾病如帕金森病、阿尔海默病、卒中的功能重建带来了希望。无论是作为脑组织移植的供体，还是作为体内诱导分化的靶细胞，NSCs都为中枢神经系统功能重建和神经再生提供了一条新的途径。但NSCs来源有限，不适于展开大规模临床应用。如何获取大量的NSC供临床使用已成为当今干细胞研究的热点和难点。近年发现骨髓MSCs和造血干细胞(hematopoldie stem cells，HSCs)可分化成神经细胞。由于脐血MSCs和骨髓MSCs有极其一致的生物学特性，脐血中的干细胞可能更原始，增殖分化能力更强；而且脐血来源广泛、取材方便，所含有的干细胞数量更多。因此使用脐血干细胞定向诱导分化为NSCs用于临床研究有广阔的应前景。
目前国内外学者已经使用多种方法从脐血中分离干细胞，最常用的方法是利用脐血干细胞体外贴壁生长的特性，将其从造血系统细胞中分离。此外，还可利用密度梯度离心、流式细胞仪分离法和免疫磁珠等方法。最近，有学者采用负极免疫筛选及限制性稀释的方法，分离得到脐血干细胞，使用流式细胞仪和免疫磁珠分离干细胞，操作方法复杂，花费高昂而且实验条件要求高。本实验结合使用密度梯度离心和体外贴壁生长的方法获得脐血MSCs，简单有效，成本低廉，对细胞损伤小，既适合各级实验室进行基础研究，也适合大规模将脐血细胞分离纯化，用于脐血干细胞建库㈣，应用于临床。
篇11
[Abstract]To observe the effect of extracts of ginseng， notoginseng， and Chuanxiong Rhizome on the cytoskeleton protein F-actin and G-actin of the replicative senescence vascular smooth muscle cells， with human aortic smooth muscle cells （HASMC） as the research object， and the replicative senescence 9th generation cells as the senescence models， the experiment was divided into youth group （5th generation cells）， model group （9th generation cells）， Chinese medicine low dose group （100 mg・L-1）， middle dose group （200 mg・L-1）， and high dose group （400 mg・L-1） and resveratrol group （10 μmol・L-1）. The intervention time was 48 h. β-Galactosidase specific staining method was used to calculate the ratio of blue dyeing cells. CCK-8 method was used to detect the cells proliferation. The flow cytometry was used to analyze the cell cycle. Immunofluorescent staining was used to observe morphological changes of F-actin and G-actin. The western blot assay was used to determine the expression of F-actin protein. Compared with the model group， the Chinese medicine groups and resveratrol group significantly reduced the number of blue dyeing cells， improved the ability of cells proliferation， reduced the number of cells in G0/G1 phase， increased the number of cells in S phase， and reduced the protein expression of F-actin and the formation of stress fibers， with obvious intervention effect and statistically significant difference. Therefore， the replicative senescence vascular smooth muscle cells can be used as the models for senescence research， with significant changes in morphology and protein expression of cytoskeleton protein F-actin and G-actin in the process of cells aging. The extracts of ginseng， notoginseng， and Chuanxiong Rhizome have obvious intervention effect on F-actin and G-actin， and it might be indirectly associated with delaying the aging of blood vessels.
[Key words]senescence； vascular aging； cytoskeleton； extracts of ginseng， notoginseng， and Chuanxiong Rhizoma
目前我国已进入老龄化社会，且形势十分严峻，预计到2050年，老龄化将达到峰值，65岁及以上人口将超过3亿，占总人口的20%以上[1]。衰老是疾病发生重要的决定性因素[2]，能够加速心血管疾病的其他危险因子。血管老化是人体衰老发生的关键因素，不仅导致动脉粥样硬化的发生，促进机体衰老的进程，而且可以诱发多种疾病[3]。血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）作为血管壁中膜的主要细胞成分，其表型转化及伴随出现的生物学行为改变是血管老化的重要病理学基础[4]。目前有研究表明，细胞骨架的动态改变是促使平滑肌细胞迁移、增殖及表型变化的重要细胞内信号[5]。肌动蛋白（actin）是细胞骨架微丝的主要成分，通常以单体（G-actin）或聚合体（F-actin）形式存在于细胞内，是研究 VSMCs中细胞骨架改变的重要检测指标，且其表达变化受细胞内相关信号因子的调控，如热休克蛋白27（heat shock protein 27，HSP27）、整合素蛋白和凝溶胶蛋白等[6]，其中HSP27调控作用最为肯定。
本课题组一直致力于益气活血中药延缓血管老化的研究，对增龄导致的生理性血管老化和高血压病导致的病理性血管老化进行了较系统的研究，同时，明确了益气活血中药延缓血管老化的一些关键作用机制，比如抗氧化应激、抗AngⅡ干预等，并明确了益气活血中药对血管老化的干预疗效。本研究以人主动脉平滑肌细胞骨架的微丝蛋白F-actin和G-actin为对象，观察益气活血中药人参三七川芎提取物对骨架蛋白F-actin和G-actin的干预作用，为进一步研究细胞骨架与血管老化的关系提供实验依据。
1材料
人主动脉平滑肌细胞HASMC（美国Sciencell公司，Cat No：6110，Lot No：7463）。
SMCM基础培养基（美国Sciencell公司）；胎牛血清（FBS，美国Sciencell公司）；生长因子（SMCGS，美国Sciencell公司）；双抗P/S Solution（美国Sciencell公司）；DPBS溶液（美国Sciencell公司）；细胞冻存液CFM（美国Sciencell公司）；胰酶/EDTA消化酶（美国Sciencell公司）；细胞衰老特异性β-半乳糖苷酶检测试剂盒（杰美基因医药上海科技有限公司）；细胞DNA含量检测试剂盒（细胞周期）（南京凯基生物科技发展有限公司）；CCK-8增殖试剂盒（上海东仁公司）；4%多聚甲醛（北京索莱宝公司）；Triton X-100穿透液（北京索莱宝公司）；罗丹明鬼笔环肽（美国Molecular Probes）；Alexa Flour 488（美国Molecular Probes）；二甲基亚砜（DMSO，北京索莱宝公司）；噻唑蓝MTT（北京索莱宝公司）；小鼠F-actin单克隆抗体（英国Abcam公司）；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（上海碧云天生物技术公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术公司）；超敏ECL化学发光试剂盒（上海碧云天生物技术公司）；高效RIPA组织/细胞裂解液（北京索莱宝公司）。
人参、三七、川芎合剂冻干粉由北京因科瑞斯医药科技公司制备提供。药物均为道地药材，单味药成分检测符合药典的规定和标准，按3∶2∶4破碎成最粗粉，经乙醇回收提取，滤过，药渣弃去，醇提液回收乙醇至无醇味浓缩液，继续浓缩至稠膏，真空减压，干燥至干膏，粉碎装袋，每1 g冻干粉含生药4.286 g。中药冻干粉用PBS配制成贮存液，以0.22 μm滤器过滤并分装，质量浓度25 g・L-1，-20 ℃保存。白藜芦醇（中国食品药品检定研究院，批号111535-200502）用DMSO溶解并配制成贮存液，质量浓度50 g・L-1 ，4 ℃保存。
倒置相差显微镜及成像系统（德国Leica，型号4000B）；流式细胞仪（美国Beckmam，型号Cytomics FC500）；全自动酶标仪（美国Thermo，型号Multiskan MK3）；激光共聚焦显微镜（日本Olympus，型号FV1000）；发光凝胶成像系统（SYNGENE，型号GeneGnome XRQ）。
2方法
2.1细胞培养及传代细胞培养一般隔天换液，待培养瓶细胞密度在90%以上时进行传代，弃去原培养基，用DPBS洗2次；加入1 mL DPBS与胰酶/EDTA混合液（比例为1∶4）；室温放置1.5 min，待细胞变圆时，轻敲瓶底，后加入2 mL完全培养基停止消化，用吸管进行吹打，收集细胞，1 000 r・min-1离心5 min，弃上清加入培养基2～3 mL吹悬，按照1∶2或1∶3传代培养。
2.2分组及药物浓度 实验分为6组，分别为青年组（5代细胞）、模型组（9代细胞）、中药低剂量组（100 mg・L-1）、中药中剂量组（200 mg・L-1）、中药高剂量组（400 mg・L-1）及白藜芦醇组（10 μmol・L-1），药物干预时间为48 h。
2.3β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色鉴定衰老的程度 β-半乳糖苷酶染色法是鉴定细胞衰老的重要指标[7]。将细胞以8×103个/孔接种于24孔板，次日细胞贴壁后，实验组给予药物干预，作用时间为48 h。实验前将GENMED染色液与GENMED稀释液以1∶20配制成工作液，混匀，置入37 ℃水浴箱预热。吸去原细胞培养基，加入500 μL/孔的GENMED清理液，并轻微摇晃24孔板；吸去清理液，加入500 μL/孔的GENMED固定液，室温孵育5 min；吸去固定液，加入500 μL/孔的GENMED酸性液，清洗细胞表面，并重复此操作一次；加入400 μL/孔预热的工作液，37 ℃孵育过夜，次日在光学显微镜下观察并计数，随机选取3个视野，计算蓝色细胞的数量占总视野细胞数量的比值。
2.4CCK-8检测细胞增殖能力将细胞以6×103个/孔接种于96孔板，每组设5个复孔，次日细胞贴壁后，实验组给予药物干预，作用时间为48 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，放入37 ℃培养箱中孵育2 h，上机检测，记录酶标仪所测定450 nm波长的吸光度（A）。
2.5流式细胞仪分析细胞周期常规进行细胞培养，实验组药物干预48 h，消化后离心并用DPBS洗涤2次，去除上清，每组加入70%冰乙醇1 mL吹悬固定，4 ℃保存过夜。次日离心后去除固定液，DPBS洗涤1次，离心去上清，每组加入100 μL RNase A 37 ℃水浴30 min，再加入400 μL PI混匀染色，4 ℃冰箱避光放置30 min，后上机检测。
2.6激光共聚焦显微镜观察细胞F-actin和G-actin结构的改变将细胞以6×103个/孔接种于黑色96孔板，贴壁后，实验组药物干预48 h。吸去原培养基，用DPBS清洗细胞2次，加入4%多聚甲醛100 μL/孔，室温下固定15 min，再用DPBS清洗细胞5 min×3遍；加入0.1% Triton X-100 100 μL/孔，室温下穿透5 min，再用DPBS清洗5 min×3遍；最后加入罗丹明鬼笔环肽2.5 μL（0.5 U）/孔和Alexafluor488 DNase I 2 μL/孔共染色，避光室温放置30 min，再用DPBS清洗5 min×3遍，上机观察F-actin和G-actin的形态学改变。
2.7Western blot 检测F-actin蛋白的表达细胞样品中加入100 μL含蛋白酶抑制剂、PMSF的RIPA 裂解液，超声波破碎仪破碎10 s，4 ℃16 000×g离心10 min，按BCA蛋白浓度检测试剂盒说明书对样品蛋白总浓度进行测定，加入样品1/4体积的5×Loading buffer，100 ℃加热10 min。进行电泳及转膜后，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，完成后用TBST洗膜3次，一抗稀释比例1∶250，4 ℃水平摇床孵育过夜。二抗用5%脱脂奶粉封闭液稀释，稀释比例1∶3 000，室温孵育60 min，TBST洗涤3×10 min。将膜平铺在干净的保鲜膜上，滴加配置好的ECL反应液反应2 min，曝光及扫描。
2.8统计学分析应用SPSS 18.0软件进行统计分析，其中计量数据以±s表示，多组样本采用单因素方差分析，用Levene法检验方差齐性，若方差齐，采用LSD法进行两两比较；若方差不齐，则采用Tamhane法。以P
3结果
3.1对SA-β-gal衰老染色的影响通过对各组染色结果的观察和计数，与青年组相比，模型组细胞蓝染数比例增多，具有显著性差异；与模型组相比，中药低、中、高剂量组及白藜芦醇组细胞蓝染数比例均明显降低，均有显著性差异（图1，表1）。
3.2对细胞增殖能力的影响各组CCK-8细胞增殖能力的检测表明，与青年组相比，模型组A明显减少，具有显著性差异；与模型组相比，中药中剂量组A明显增加，具有显著性差异，中药低剂量组A增加，具有差异性，而中药高剂量组及白藜芦醇组A增加，但无统计学意义（表1）。
3.3对细胞周期的影响通过对各组流式细胞周期的检测表明，与青年组相比，模型组G0/G1期细胞明显增多，S期细胞减少，均有显著性差异；与模型组相比，中药中、高剂量组及白藜芦醇组G0/G1期细胞明显减少，S期细胞增多，具有显著性差异，中药低剂量组则无统计学意义；G2/M期细胞数目变化均无统计学意义（表2）。
A.青年组；B.模型组；C.中药低剂量组（100 mg・L-1）；D.中药中剂量组（200 mg・L-1）；E. 中药高剂量组（400 mg・L-1）；F.白藜芦醇组（10 μmol・L-1）（图2，3同）。
3.4对细胞F-actin和G-actin形态学的影响激光共聚焦显微镜显示，青年组细胞排列紧密，F-actin（红染）主要在细胞表面及外周分布，线条完整连续；G-actin（绿染）主要在细胞的中央区域分布，呈致密的椭圆形，染色清晰、饱满、圆润。模型组细胞体积变大，形态不规则，F-actin边缘毛糙不规整，出现锯齿样断裂，部分呈纵向平行排列，形成大量应力纤维；G-actin向细胞周边区域伸展，部分出现边缘变模糊呈絮状，细胞中央区域染色变弱。模型组与青年组相比，F-actin/G-actin荧光强度比值增大，具有显著统计学差异。各给药组F-actin边缘较模型组清晰光滑，且较少断裂；G-actin则主要集中于细胞中间，染色略欠饱满，尚清晰圆润。与模型组相比，中药低、中剂量组及白藜芦醇组F-actin/G-actin荧光强度比值降低，具有统计学意义，中药高剂量组则无统计学意义（图2，表3）。
3.5对F-actin和HSP27蛋白表达的影响与青年组相比，模型组的F-actin蛋白表达明显增多，具有显著差异性；与模型组相比，中药中、高剂量组及白藜芦醇组F-actin蛋白表达减少，具有显著差异性；与青年组相比，模型组HSP27蛋白表达明显减少，具有显著差异性；与模型组相比，中药低、中、高剂量组及白藜芦醇组HSP27蛋白表达明显增多，具有显著差异性（图3，表3）。
4讨论
衰老是不可抗拒的自然规律，而血管衰老是人体衰老的关键始发因素[8]。 在血管老化的过程中，中膜平滑肌细胞高增殖、高移行、分泌性改变是内膜增厚、血管重构的关键因素。VSMC发生表型转化的过程中伴随着细胞骨架的重构，同时骨架重构又是VSMC由收缩型向合成型转化过程中细胞收缩能力下降、发生迁移和黏附等改变的病理生理基础[4]。肌动蛋白是构成细胞骨架微丝的基本成分，以单体G-actin或聚合体F-actin形式存在，肌动蛋白具有收缩、保持细胞的形状、运动、细胞间黏附等多种功能，同时参与细胞增殖过程[9]。有研究表明，调节机体衰老的多条通路均与F-actin的改变密切相关，如哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路、胰岛素/胰岛素样生长因子（IGF-1）通路和去乙酰化酶（SIRTS）通路等[10-12]。
气血是构成机体的基本物质，二者关系密切，随着衰老的进行，气虚血不行，血虚气不化，气虚血少，气血运行不畅，最终导致气虚血瘀之证，从而加速了机体衰老的进程。中药人参、三七、川芎合方属于益气活血治法的范畴，在心脑血管疾病中被广泛应用，三药合剂具有延缓血管衰老、保护血管内皮细胞及调节血管活性物质等作用[13-14]。白藜芦醇具有激活SIRT1通路、抗氧化、调节自噬及保持端粒酶活性等作用，是目前比较公认的延缓衰老的对照药物。
本研究以复制性衰老的血管平滑肌细胞为对象，以β-半乳糖苷酶染色、CCK-8细胞增殖活性和细胞周期作为判断细胞衰老程度的指标，并观察人参三七川芎提取物延缓细胞衰老的作用。实验结果表明衰老的细胞多停滞在细胞周期的G1期，S期细胞数量则减少，且体外增殖能力相对减弱，同时形态学表现出细胞扁平、胀大、颗粒增多的特征，并且在酸性环境下，细胞内β-半乳糖苷酶活性增加，表现为细胞蓝染数目增多。药物干预后，停滞在G1期的细胞数量减少，同时S期细胞数量增加，且β-半乳糖苷酶染色细胞蓝染数目减少，表明人参三七川芎提取物具有延缓血管平滑肌细胞衰老的作用。细胞骨架方面，青年组细胞微丝结构以单体G-actin为主，主要在细胞的中央区域分布，呈致密的椭圆形，染色清晰、饱满、圆润；聚合体F-actin主要在细胞表面及外周分布，线条完整连续。模型组G-actin向细胞周边区域伸展，部分出现边缘变模糊呈絮状，细胞中央区域染色变弱；F-actin边缘毛糙不规整，出现锯齿样断裂，部分呈纵向平行排列，且蛋白表达量增加，形成大量应力纤维。药物干预后，F-actin边缘较模型组清晰光滑，且较少断裂，蛋白表达量减少；G-actin则主要集中于细胞中间，染色略欠饱满，尚清晰圆润。而HSP27作为细胞骨架蛋白的主要调控因子，反向调节着F-actin的表达。
综上所述，复制性衰老的血管平滑肌细胞可以作为衰老研究的模型；细胞骨架微丝蛋白G-actin和 F-actin形态及蛋白表达在细胞衰老过程中改变明显，其可能直接参与平滑肌细胞由收缩型向合成型转化等衰老的进程；人参三七川芎提取物可以一定程度上延缓血管老化，且对于细胞G-actin和 F-actin有明显干预作用，其可能间接通过此作用延缓了血管老化的进程。
[参考文献]
[1]沈自尹.重视衰老与老年相关疾病的研究[J].成都医学院学报，2012，7（3）：335.
[2]Harman D. Extending functional life span[J]. Exp Gerontol，1998，22：95.
[3]Lakatta E G.Arterial and cardiac aging： major shareholders in cardiovascular disease enterprises： part Ⅲ： cellular and molecular clues to heart and arterial aging[J]. Circulation，2003，107 （3）：490.
[4]徐益荣，卢玉仙，王育林. 血管平滑肌细胞表型转化与骨架蛋白表达之间的关系[J]. 南通大学学报，2013，33（2）：86.
[5]Maria Grazia Lampugnani. Endothelial adherens junctions and the actin cytoskeleton： an infinity net[J]. J Biol， 2010， 9： 16.
[6]Jones T J， Adapala R K， Geldenhuys W J， et al. Primary cilia regulates the directional migration and barrier integrity of endothelial cells through the modulation of hsp27 dependent actin cytoskeletal organization[J]. J Cell Physiol，2012，227（1）：70.
[7]Yanaka M，Honma T，Sato K，et al. Increased monocytic adhesion by senescence in human umbilical vein endothelial cells[J]. Biosci Biotechnol Biochem，2011，75（6）：1098.
[8]阮云军，银孟卓，吴赛珠. 血管老化的研究进展[J].实用老年医学，2006，20 （6）：418.
[9]Flavahan N A，Bailey S R，William A，et al. Imaging remodeling of the actin cytoskeleton in vascular smooth muscle cells after mechanosensitive arteriolar constriction[J]. Am J Physiol Heart Cire Physiol Flavahan，2005，288（2）：H660.
[10]Harkcom W T，Ghosh A K，Sung M S，et al. NAD+ and SIRT3 control microtubule dynamics and reduce susceptibility to antimicrotubule agents[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2014，111（24）：E2443.
[11]Niles B J，Powers T. TOR Complex 2-Ypk1 signaling regulates actin polarization via reactive oxygen species（ROS）[J]. Mol Biol Cell，2014，25（24）：3962.
篇12
[关键词] 富血小板纤维蛋白； 富血小板血浆； 脂肪干细胞； 成骨分化
[中图分类号] R 783 [文献标志码] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.06.019
口腔种植技术已经广泛用于缺失牙及牙列的修复中，种植体与骨之间如何能达到稳定的骨结合一直是研究的热点。从人血液中提取的富血小板血浆
（platelet-rich plasma，PRP）富含多种生长因子，可以促进组织再生[1]。目前有许多学者将其用于口腔
种植研究中，但效果差异较大。富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）是一种区别于传统PRP技术的富含细胞因子和生长因子的新一代血小板浓缩物，于2001年由Choukroun等[2]提取出来，因此又称
为Choukroun’s PRF。PRF的分子结构类似于天然血凝块，可以借助细胞因子的调节作用以及纤维蛋白的支架作用进行组织修复[3]。与PRP比较，PRF制备时无需添加任何生物制剂，同时还具有促进成骨及炎症调节的能力，能够独立应用以修复小范围的骨缺损，也可以与骨移植材料联合应用进行大范围骨缺损的修复。但是目前对PRF和PRP释放细胞因子的情况，以及对靶细胞作用效果的差异的研究还较少，本研究主要对不同时间点提取的PRF和PRP析出液中生长因子的质量浓度进行测定，并探讨二者对脂肪干细胞（adipose tissue-derived stem cell，ADSCs）增殖分化的影响，以便为临床及组织工程研究选择合适的支架材料提供参考。
1 材料和方法
1.1 主要试剂
高糖α-MEM培养液、胎牛血清（fetal bovine se-rum，FBS）、青霉素、链霉素、胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶（Gibco公司，美国），碱性磷酸酶（alkaline phospha-
tase，ALP）试剂盒（南京建成生物工程研究所）、血小板源性生长因子-AB（platelet derived growth factor-
AB，PDGF-AB）酶联免疫吸附试验（enzyme linked
immunosorbent assay，ELISA）试剂盒、转化生长因
子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）ELISA试剂盒（上海希美生物科技有限公司）。
1.2 原代细胞的培养
无菌切除兔腹股沟处的脂肪组织，D-hanks液冲洗3次。在超净工作台上用无菌剪将其剪成乳糜状后收集于离心管中，加入2倍体积的质量浓度为3 g·L-1的Ⅰ型胶原酶，置37 ℃恒温摇床上振荡消化30 min，然后加入等体积的含10%FBS的α-MEM培养液终止消化。200目滤网过滤后1 000 r·min-1离心5 min，倾去上层残余脂肪以及上清液，用含10%FBS的α-MEM培养液重悬细胞，接种在培养瓶中，置于37 ℃含5%CO2的培养箱中静置培养，24 h后细胞贴壁，换液，以后每3天换液1次。每日用倒置相差显微镜观察细胞的生长形态，待细胞长满80%时，0.5 g·L-1胰蛋白酶消化，1∶3传代培养，取第3代细胞用于实验。
1.3 ADSCs的鉴定
采用多向诱导分化（成脂和成骨诱导）的方法鉴
定ADSCs。
成脂诱导方法如下。细胞长满培养瓶底后，常规消化并收集细胞，将细胞以每毫升2.1×104个细胞的密度接种于6孔板中，置于细胞培养箱中培养，常规换液。当细胞完全融合后弃培养液，更换成脂诱导液a（含α-MEM培养液、青霉素、链霉素、1 μmol·L-1地塞米松、0.5 mmol·L-1 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、200 μmol·L-1吲哚美锌、10 μg·mL-1胰岛素），诱导3 d后，弃去诱导液a，更换为保持液b（含α-MEM培养
液、青霉素、链霉素、10 μg·mL-1胰岛素），1 d后再次换为诱导液a诱导。诱导顺序为：诱导3 d、保持
1 d，如此重复4次，最后诱导5 d。诱导21 d后，进行油红O染色。
成骨诱导方法如下。待培养的ADSCs达到80%融合时，常规消化收集细胞。将细胞接种于6孔板中，每孔的细胞密度为每毫升1×104个，加入2 mL细胞培养液置于细胞培养箱中培养，24 h后弃培养液，每孔加入2 mL成骨诱导液（含α-MEM培养液、0.1 μmol·L-1地塞米松、50 mg·L-1维生素C、10 mmol·L-1 β-甘油磷酸钠）进行诱导，每3 d换液1次，诱导21 d后进行茜素红染色。
1.4 PRF与PRP析出液的制备
PRF制备：无菌抽取兔耳中央动脉血10 mL至真空负压管中，立即于3 000 r·min-1离心15 min，兔血可分为3层，最底层为红细胞层（red blood cells，RBC），表层为贫血小板血浆（platelet-poor plasma，PPP）层，中间层即为PRF。
PRP制备：无菌抽取兔耳中央动脉血10 mL至含枸橼酸钠抗凝剂的负压管中，1 000 r·min-1离心15 min，吸取上清液及交界面下1～2 mm深的红细胞至另一个离心管内，3 000 r·min-1离心8 min，弃去上清液的上3/4，轻轻振荡后即为PRP。将PRP与凝血剂（含10%氯化钙和1 000 U凝血酶）混合后摇匀，PRP即被激活呈凝胶状。
将制备好的PRF与PRP分别置入含5 mL α-MEM培养液的离心管中，37 ℃条件下静置，于1、7、14、21、28 d时收集PRF和PRP析出液，在每个时间点取出析出液后，再于离心管中加入5 mL新鲜的α-MEM培养液，待下一个时间点收集析出液。实验前将收集的析出液-80 ℃保存备用。
1.5 TGF-β1与PDGF-AB质量浓度的测定
使用ELISA试剂盒对PRF和PRP析出液中TGF-β1与PDGF-AB的质量浓度进行检测，按照试剂盒说明书进行操作。
1.6 ADSCs增殖的检测
取生长良好的第3代ADSCs，以每孔1.5×104个细
胞的密度接种于7块48孔板中，24 h后换液，用无血清培养液培养24 h，使细胞状态同步化。细胞分为12组，分别使用不同的培养液进行培养，即阳性对照组、实验组（PRF1、PRF7、PRF14、PRF21、PRF28、PRP1、PRP7、PRP14、PRP21及PRP28）以及阴性对照组。阳性对照组使用含10%FBS的α-MEM培养液培养（含10%FBS、100 U·mL-1链霉素、100 U·mL-1青霉素），阴性对照组使用无血清的α-MEM培养液培养，其余10组分别使用不同时间点PRF和PRP（分别为1、7、14、21、28 d）析出液配制α-MEM培养液
培养（含体积分数10%PRF或PRP析出液、100 U·mL-1
链霉素、100 U·mL-1青霉素），每组分别追加3个复孔，培养1～7 d。
每日选择1个孔板对12组不同培养条件下的细胞进行消化，分别用血球计数板在倒置显微镜下进行计数，取其均数，操作重复3次。以时间（d）为横坐标，细胞计数为纵坐标，绘制细胞的生长曲线。
1.7 ALP活性检测
取生长良好的第3代ADSCs，以每孔1.5×104个细胞的密度接种于48孔板中，24 h后换液，用无血清培养液培养24 h，使细胞状态同步化。细胞分为12组，同1.6。阳性对照组使用含10%FBS的α-MEM成骨诱导液培养（含10%FBS、0.1 μmol·L-1地塞米松、
50 mg·L-1维生素C、10 mmol·L-1β-甘油磷酸钠），阴性对照组使用无血清的α-MEM成骨诱导液培养，其余10组使用不同时间点PRF和PRP析出液配制α-MEM成骨诱导液培养（含体积分数10%PRF或PRP析出液、
0.1 μmol·L-1地塞米松、50 mg·L-1维生素C、10 mmol·L-1 β-甘油磷酸钠）。连续培养7 d，常规换液。
培养7 d后，弃培养液，PBS漂洗细胞，每孔加入150 μL的1%TritonX-100，冰上裂解10 min，显微镜观察细胞破碎情况，收集细胞并离心，用微量移液器吸取上清，按照ALP操作试剂盒进行检测，酶标仪下测定光密度（optical density，OD）值，波长520 nm。按试剂盒提供的公式计算ALP活性，实验重复3次。
1.8 统计分析
使用SPSS 11.0软件进行统计学分析，样本用x±s表示，检验水准为双侧α=0.05。
2 结果
2.1 ADSCs鉴定结果
ADSCs的成脂、成骨诱导结果见图1、2。成脂诱导3 d左右，细胞形态由长梭形变为类圆形，与脂肪细胞相似，部分细胞的细胞质内出现折光性强的小液滴；持续成脂诱导，液滴的数量增多，且融合成大液滴；诱导3周后进行油红O染色，可见细胞质中的液滴被染为红色，即为脂滴（图1）。成骨诱导3～4 d，细胞形态发生改变，由长梭形变为三角形或多边形，类似成骨细胞的形态；诱导7 d左右可见少量细胞外基质沉淀，诱导时间越长，沉淀越明显；诱导3周后进行茜素红染色，可见钙结节形成（图2）。
2.2 TGF-β1与PDGF-AB的质量浓度
不同时间点PRF和PRP中TGF-β1和PDGF-AB的质量浓度见表1。PRF中，TGF-β1的质量浓度随静置时间的增加而逐渐升高，PRF14组达到高峰，其后下降；PDGF-AB的质量浓度亦随静置时间的增加而升高，PRF7组达到高峰，其后下降。PRP中，TGF-β1和PDGF-AB的质量浓度在PRP1组均最高，其后随静置时间增加而下降。经统计学检验，PRP中TGF-β1和PDGF-AB的质量浓度除了PRP1组高于同时间点的PRF1组外，其余时间点均低于相应的PRF组（P
0.05）。
2.3 PRF与PRP对ADSCs增殖作用的影响
12组ADSCs细胞的生长曲线见图3。PRF组中，PRF14组的ADSCs增殖程度高于其余PRF组、阴性对照组和阳性对照组（P
ADSCs增殖程度高于其余PRP组、阴性对照组和阳性
对照组（P
组的ADSCs增殖程度均分别高于PRP7、PRP14组，PRP1组的ADSCs增殖程度高于PRF1组，上述差异均有统计学意义（P
2.4 ALP活性检测结果
培养7 d后，阳性对照组和阴性对照组的ALP活性分别为4.479±0.326和3.363±0.127，PRF和PRP各组的ALP活性检测结果见表2。
PRF14和PRP1组的ALP活性最高，且两者之间无明显差异（P>0.05）；PRF14组ALP活性高于其余PRF组、阳性对照组和阴性对照组；PRP1组的ALP活性高于其余PRP组、阳性对照组和阴性对照组（P
3 讨论
PRP中富含多种生长因子，其生长因子来源于血小板，但它在促进组织修复中的作用备受争议。研究[4-5]表明，PRP形成的凝胶块中所含有的血小板以
及生长因子的作用时间仅限于早期阶段，不可能作用于组织修复的全部过程。Choukroun’s PRF技术的操作简单且成本低廉，被称为第2代血小板浓缩物[6]。
PRF具有良好的促进软硬组织再生的作用[7-8]，近年
来PRF已经初步应用于口腔种植领域中。与PRP相比，PRF更注重纤维蛋白的作用，其内的纤维蛋白能将血小板和释放的生长因子以化学键结合，通过缓慢释放，延长生长因子的作用时间[6]。本研究检测了PRF与PRP在不同时间点释放的TGF-β1与PDGF-AB的质量浓度，发现PRF中TGF-β1与PDGF-AB的质量浓度随时间的延长而增加，TGF-β1在14 d时最高，PDGF-AB在7 d时最高，其后逐渐减少；相反，PRP中TGF-β1与PDGF-AB均在第1天时质量浓度最高，随后迅速下降。此结果进一步证实了PRF可以缓慢释放生长因子的结论。PRF中的血小板像黏结剂一样浸入到纤维蛋白网内，其中的白细胞具有活性并且可以在密集的纤维蛋白网状结构中产生作用[9]。PRF与PRP促进ADSCs增殖和分化的作用有赖于其中的TGF-β1与PDGF-AB。本实验测定了PRF和PRP对ADSCs增殖分化的作用，结果发现：PRP组中，ADSCs的细胞增殖活性及ALP活性均在早期阶段较高，随时间的延长而降低；PRF组中，ADSCs的细胞增殖活性及ALP活性随时间的延长逐渐增高，14 d达到最高，其后下降。该结果与细胞因子的检测结果类似。由此可以推测，与PRP相比，PRF可以明显延长对组织修复的效果。PRP的作用在早期阶段最强，可能是以往的研究中其成骨效果差异较大的原因之一，因为其成骨作用不能作用于组织修复的全过程。
与PRP相比，PRF制备简单且操作容易，已经作为一种新型的自体材料初步应用于口腔种植临床中[10-11]。本实验进一步表明了PRF能缓慢持久地释放生长因子，可更加有效地促进ADSCs的增殖和分化，为PRF的临床应用及组织工程学研究提供了新思路。
[参考文献]
[1] Assoian RK， Grotendorst GR， Miller DM， et al. Cellular transfor-
mation by coordinated action of three peptide growth factors from
human platelets[J]. Nature， 1984， 309（5971）：804-806.
[2] Choukroun J， Adda F， Schoeffler C， et al. Une opportunité en pa-
roimplantologie： Le PRF[J]. Implantodontie， 2001， 42：55-62.
[3] Dohan DM， Choukroun J， Diss A， et al. Platelet-rich fibrin（PRF）：
A second-generation platelet concentrate. Part Ⅱ： Platelet-related
biologic features[J]. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol
Endod， 2006， 101（3）：e45-e50.
[4] Consolo U， Zaffe D， Bertoldi C， et al. Platelet-rich plasma activity
on maxillary sinus floor augmentation by autologous bone[J]. Clin
Oral Implants Res， 2007， 18（2）：252-262.
[5] 邓悦， 王万春， 徐棣， 等. 富血小板血浆对表面多孔性种植体周
骨再生的作用[J]. 中国口腔种植学杂志， 2006， 11（2）：51-54.
Deng Yue， Wang Wanchun， Xu Di， et al. Bone regeneration around
sintered porous-surfaced implant with PRP： An animal experiment
[J]. Chin J Oral Implant， 2006， 11（2）：51-54.
[6] Dohan DM， Choukroun J， Diss A， et al. Platelet-rich fibrin（PRF）：
A second-generation platelet concentrate. Part Ⅰ： Technological
concepts and evolution[J]. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral
Radiol Endod， 2006， 101（3）：e37-e44.
[7] Choukroun J， Diss A， Simonpieri A， et al. Platelet-rich fibrin（PRF）：
A second-generation platelet concentrate. Part Ⅳ： Clinical effects
on tissue healing[J]. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol
Endod， 2006， 101（3）：e56-e60.
[8] Choukroun J， Diss A， Simonpieri A， et al. Platelet-rich fibrin（PRF）：
A second-generation platelet concentrate. Part Ⅴ： Histologic eva-
luations of PRF effects on bone allograft maturation in sinus lift
[J]. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod， 2006， 101
（3）：299-303.
[9] Dohan Ehrenfest DM， Diss A， Odin G， et al. In vitro effects of
Choukroun’s PRF（platelet-rich fibrin） on human gingival fibro-
blasts， dermal prekeratinocytes， preadipocytes， and maxillofacial
osteoblasts in primary cultures[J]. Oral Surg Oral Med Oral Pathol
Oral Radiol Endod， 2009， 108（3）：341-352.
[10] Simonpieri A， Del Corso M， Sammartino G， et al. The relevance
of Choukroun’s platelet-rich fibrin and metronidazole during com-
plex maxillary rehabilitations using bone allograft. Part Ⅱ： Implant
surgery， prosthodontics， and survival[J]. Implant Dent， 2009， 18（3）：
220-229.
[11] Diss A， Dohan DM， Mouhyi J， et al. Osteotome sinus floor eleva-
