生物学论论文范文

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1.2杨梅雌雄花序内部微观结构研究隔2d采集1次杨梅的雌雄花序，甲醛-乙醇-醋酸混合固定液（FAA）固定，之后进行常规石蜡切片及曙红染色。

1.3杨梅花粉萌发活力测定采用荧光染色法（FCR，fluorochromereaction），参照Sato等的方法略有改进。从即将散粉的花药中收集花粉，隔24h测定1次花粉活力，花粉活力测定过程中，设置3个重复，荧光显微镜下观察并统计花粉活力。

2结果与分析

2.1杨梅雄花生物学特征

2.1.1杨梅雄花序特征杨梅雄花序为柔荑花序，长1～3cm（图1-1），小花着生在主穗轴上，无花冠和花萼，小花主要由8～20枚花药组成，花药外面有2～3个苞片包裹（图1-2～4）。雄花序从花药形成到成熟散粉期间，其花药颜色依次经历暗红色、黄红色、鲜红色的变化。花药变成鲜红色后（图1-5），花丝伸长，花药进一步散开外露，开始散粉，通常是位于花序中下部位的小花先散粉（图1-6），随后其他部位的小花散粉。散粉过程中，花药二叉开裂，花粉较多（图1-7～8），散粉后的花药干枯脱落。

2.1.2杨梅雄花序显微结构及发育杨梅花药具有4个花粉囊，中部具有药隔（图2-1），花粉囊壁具有纤维层、中层和绒毡层3层（图2-2）。3月上旬，花药中的多数花粉母细胞处于减数第1次分裂前期（图2-2），3月中旬，则处于四分体发育时期，大部分四分体以四面体型存在（图2-3，淡色箭头所示），少数排列在一个平面上以十字交叉型存在（图2-3黑色箭头所示），故杨梅花粉母细胞胞质分裂主要以同时型为主，少量为连续型。3月中旬到4月初，由四分体分离出来的小孢子经过一系列的发育过程发育成熟，成熟花粉粒具有2个细胞核和3个萌发孔（图2-4）。

2.1.3杨梅花粉活力荧光染料本身不产生荧光，无极性，可以自由地透过完整的原生质膜，进入原生质后，与原生质内的酯酶作用形成一种能产生荧光的极性物质，荧光越强，表明花粉活力越强［20］。荧光染色结果表明：刚散粉的杨梅花粉染色活力非常强，在90%以上（图2-5），室温条件下放置24h后，对其活力影响不大，48h之后，其花粉活力急剧下降，仅有约69%的花粉具有染色活力，72h之后，约52%的花粉具有染色活力，96h之后，花粉荧光非常弱，几乎不具有染色活力。

2.2杨梅雌花生物学特征

2.2.1杨梅雌花序特征及发育杨梅雌花与雄花类似，为柔荑花序，长0.5～1.5cm（图3-1），小花着生在同一花序轴上，主要由柱头、花柱和子房3个主要部分组成，花柱极短，柱头两裂，呈“Y”状，小花外面有2～4个苞片包被（图3-7～10）。3月初，杨梅的雌花仍由苞片包被，整个雌花序成绿色（图3-2）。3月中下旬，杨梅雌花苞片展开，柱头开始外露，通常位于花序中上部的小花柱头最先显现（图3-3），随后，其他部位的柱头陆续外露展开，外露的柱头呈“Y”状张开不断向外生长，最后完全展开（图3-4～9）。与雄花序相类似，杨梅雌花序在发育过程中，其柱头颜色依次经历着淡红色—鲜红色—红色—深红色的变化过程，外部的苞片也经历着嫩绿色—黄绿色—中间绿色边缘微红色—绿色等不同程度的颜色变化过程。

2.2.2杨梅雌花内部微观结构杨梅子房为单心皮，1室，其底部与花托相连，其余部分均独立，属于上位子房（图4-1），胚珠各方向生长速度均匀一致，珠孔、合点和珠柄三者在一条直线上，在胚珠类型上属于直生胚珠，单珠被（图4-2～4）。珠被在发育过程中并非把珠心全部包住，而在珠心顶部留1个小孔，即珠孔（图4-5）。杨梅大孢子母细胞形成时，在大孢子母细胞外层有4～5层细胞包裹，因此在珠心类型上，杨梅属于厚珠心型（图4-6）。

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2萌生枝条

构树也可以通过根生萌枝和茎生萌枝实现更新。构树根系发达，根蘖能力强，熊佑清指出，3～5a生的构树在2a内，通过自然分蘖每年能增新株20～35株，覆盖面约200～500m2。对构树的根段进行埋条，其成活率平均达到53％，以沙土为基质时高达81％。在野生构树群落内，一些植株主干顶端枯死或被折断，茎下部一定部位会萌发出新芽并发育成茎生萌枝。魏媛等研究表明，光照强度、截断、抹芽、喷施植物生长调节剂等均能对构树芽的萌发产生影响。

3构树的人工繁殖育苗

3．1种子育苗构树种子人工留种播种后发芽率低，田间发芽率仅4％。水分、土壤、温度和光照等外界条件对构树种子萌发具有影响。构树种子最适宜的萌发条件为温度30℃、12h光照＋12h黑暗的光照条件和正常湿度。对种子进行预处理，可以提高构树种子的萌发率。孙永玉等用浓度为25mg／L的NAA处理构树种子，种子发芽率高达70．5％；用浓硫酸处理构树种子，各项发芽指标明显优于其他处理。杨帆等、吴纲等用不同浓度的NaCl处理构树种子，发现低浓度的NaCl对构树种子的萌芽具有一定的促进作用。

3．2扦插育苗构树根插成活率较高，但会对母株造成一定损害，因此不适宜大规模应用。彭玉华等研究了不同季节、构树不同类型穗条的扦插生根情况，结果表明，构树扦插成活率在春季最好，应选择半木质化穗条，顶芽次之，夏季选择顶芽穗条最好，秋冬季节各种类型穗条都不理想。但总体看，构树枝插育苗生根较难，尤其是硬枝扦插成活率很低。应用生根粉处理插穗，能提高构树穗条扦插成活率。周鑫等指出，选择直径为0．9～1．3cm的嫩枝插穗，用浓度为200～300mg／kg的生根粉处理，插穗上端封蜡，延长了插穗的存活期。韩高辉等的研究表明，用911生根粉以150×10－6溶液浸泡24h处理时，可显著提高插穗成活率，平均成活率达88．6％。

4构树的生态学

4．1水分胁迫对构树的影响构树具有一定的耐旱潜力。干旱胁迫下，构树具有稳定的碳酸酐酶活性、较高的光能转化效率、电子传递速率及净光合速率来对抗干旱逆境［25］。构树具有一定的抗涝能力。王哲宇等探究了淹水胁迫对1年生的构树幼苗的影响，试验结果表明，淹水胁迫抑制了构树幼苗的高度增长，而对其地径增长和不定根的形成具有一定的促进作用。

4．2土壤理化性质对构树的影响构树对土壤酸碱度的变化具有较好的适应性。在喀斯特地区，构树对钙具有较强的吸收能力，表现出对喀斯特地区较强的适应性。在天津盐碱地的栽培试验显示，构树在重盐试验地、重碱试验地和中盐中碱试验地的成活率分别为79．3％、93．2％、96．6％，这表明构树在盐碱地的绿化建设中可以大规模推广。王金山等在环渤海湾试验基地进行了构树的连续种植试验，进一步证明了杂交构树作为绿化树种在盐碱地种植的可行性。构树在轻中度酸胁迫下能通过自身调节适应环境，具有中度抗土壤酸化能力。陈家法等［31］在土壤呈弱酸性的冷水江锑矿区进行了种植研究，发现构树在该区域的成活率在90％以上，年树高生长量在0．7m以上，4a生构树郁闭度为0．75，在较短时间内可恢复矿区植被。构树在修复矿区土壤、实现生态重建上具有发展潜力。

4．3污染物对构树的影响

4．3．1大气污染构树具有较强的吸收二氧化硫、氯气等污染气体的能力，吸滞粉尘能力强，在城市园林应用中，具有改善生态环境的作用。赵林峰等选取衡阳市4个采样点对构树叶片进行了叶片滞尘能力及硫、氯含量的测定，结果显示，构树滞尘能力显著，在车流量大的国道上吸附沙尘量最大；工业园区扬尘量较少，叶片含硫、氯值较高。张家洋等在不同季节对构树的叶片取样进行滞尘能力测定，结果显示构树滞尘能力强，其滞尘能力表现为秋季＞春季。张庆费调查发现，在污染严重的厂区，构树抗污性强于香樟、悬铃木、女贞、水杉、雪松等树种。

4．3．2土壤污染构树对重金属污染土壤具有耐受性，能够富集重金属，对受重金属污染土壤具有生态修复功能。当土壤镁粉尘施加量小于10％时，可促进构树生长。赖发英等发现重金属Cu、Zn在构树体内的富集浓度是根部＞叶部＞茎部，其富集系数都在0．5以下，但由于其地上部分生物量很大，能够从土壤中移除大量的重金属。康薇等对湖北古铜矿遗址区的构树进行了调查，发现构树的地上部分对Cu、Cd、Pb的综合富集系数较高，具有较强的富集能力，对Pb的富集效果尤其明显，因而适宜在Pb污染区栽植。

4．4构树的种群特征对野生构树种群特征的了解是理解种群更新的重要基础。对野生构树种群分布格局的研究表明，幼树或者灌木层构树，个体数量较多，种群聚集强度大；大树或者乔木层构树，种群格局由聚集分布变为随机分布。构树的生态位较宽，且与其他树种的生态位重叠较少，构树是南京幕府山植物群落的主要优势树种［43］。在野外，构树种群的主要干扰因子是砍伐和樵采，在强度干扰下，构树的幼苗、幼树个体往往较多，种群更新能力强，而随着干扰强度减弱，构树的更新能力呈现衰退趋势；中度干扰最利于萌枝的形成和发育。

5构树的园林应用

开发利用乡土野生植物资源是园林建设的重要任务。构树树干挺拔，枝叶茂密，速生耐修剪，适应性强，叶形叶色变化丰富，雌株果期极具观赏价值，植株抗大气污染和富集重金属，根系可固沙固土，具有改善生态环境的功能，在园林应用上具有重要潜力。目前，构树在喀斯特地区、废弃矿区、滨海盐碱地、工业园区以及城市绿化中（作者观察）得到应用。同时，构树的新品种选育已经取得了进展，王凤英等培育出稳定的黄色叶构树，陈建业等培育出斑叶构树和金叶构树，构树新品种的诞生使其在园林上的应用形式更加丰富。然而，长期以来构树并未得到园林工作者的足够重视，大多仍处于野生状态。为了大力推广构树在园林上的应用，需要对其以不同的指标进行综合的量化评价，以客观的形式证实构树应用的可靠性和可行性。

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Palmer等在人类上皮细胞应用siRNA技术沉默Tctex-1发现，出现了比对照组wt-Tctex-1更长的纤毛，此现象与运用同样方法沉默动力蛋白重链-2（DHC2）导致的初级纤毛延长相似，同时发现，抑制DHC2会引起Tctex-1的伴随损失。相比单个亚基的沉默，DHC2和Tctex-1用siRNA技术双沉默能导致更长的纤毛。早期的研究表明，DHC2与中间轻链LIC3（D2LIC）特异性相互作用参与初级纤毛的形成和功能，因此，证明Tctex-1是纤毛长度的关键调节因子，且该过程可能是通过Tctex-1动力蛋白依赖[25]性途径实现的。T94磷酸化Tctex-1连接纤毛重吸收与细胞重新进入S期过程，添加外源性Tctex-1（T94E）突变体能加速细胞纤毛吸收并促使其进入S期；然而，在非纤毛细胞中Tctex-1不能促使细胞进入S期。研究表[26]明肌动蛋白参与了Tctex-1调控纤毛吸收过程。在Tctex-1连接纤毛重吸收和细胞重新进入细胞周期的过程中，胰岛素样生长-1（IGF-1）磷酸化细胞纤毛的IGF-1受体（IGF-1R），进而活化AGS3调节Gβγ信号通路，随后招募磷酸（T94）Tctex-1选择性富集到纤毛过渡区，促有丝分裂信号转导使纤毛重吸收进一步加速G1-S期进程。在皮质区干细胞中干扰这一途径的任何环节都将影响神经元细胞增殖时的成熟分化。在大脑皮质（duringcorticogenesis）中，纤毛传导的非经典IGF-1R-Gβγ–phospho（T94）Tctex-1信号通路通过调节纤毛重吸收和细胞周期[13]G1期的长短进而促进神经干细胞的增殖和分化。此外，有报道证明食欲素（OX-A,OX-B）参与睡眠-觉醒周期的调节，Tctex-1与食欲素受体1（OX1R）[27]相作用，进而调节OX-A信号传导。据报道Tctex-1参与人瘤病毒等感染引起的肿瘤发生过程，同时，Tctex-1也参与抑癌基因REIC/Dkk-3的信号传导，Tctex-1表达下调削弱了其对GEF-H1的抑制作用从而引发白血病。

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例如，课前安排学生收集课程资源，走进他们所生活、学习的社区和校园，调查栽培在他们身边的裸子植物和被子植物，拍摄这些裸子植物和被子植物的照片，收集它们的球果或果实。在拍摄和收集活动前，教师强调要爱护植物，最好收集自然脱落的球果或果实，不随意采摘或踩踏。课堂上展示收集到的资源，让学生将混杂在一起的裸子植物和被子植物的球果和果实分别挑出来，让大家分享成果，感受社区和校园环境的美，提高学生调查和观察能力，获取感性认识，初步学会区分裸子植物和被子植物。然后，让学生在家长的陪同下或以小组为单位，走进农贸市场，观察和收集舌尖上的课程资源，区分开市场上出售的裸子植物和被子植物，收集它们的种子和果实。课堂上展示所收集到的种子和果实，说出判断它们是裸子植物和被子植物的依据，交流在此调查过程中了解到的它们与周围生活的关系，让学生在日常生活中认识并能区分更多的裸子植物和被子植物，切身感受周围的生活离不开它们，形成关注生活、热爱生活、热爱家乡和自然的情感，增进亲情，培养合作精神和与人交流的能力，加深对裸子植物和被子植物的主要特征这一重要概念的理解，突出教学重点、突破教学难点。

上述活动可为每一位学生提供创新的机会，在参与活动中，让每位学生以自己独特的方式去调查、收集，将理论与实践相结合，获得直接经验;展示和交流时共享他人的资源，开阔全体学生获取资源的天地。

2加工课程资源，拓展教学内容

教材为适应不同地区、不同学校办学条件的差异和学生个性化、多样化发展的需要，在内容的选取上具有一定的弹性和灵活性。这为课堂教学中利用课程资源，创新课堂教学留下了自主的空间。围绕课堂教学目标，将收集到的课程资源进行加工处理，对教学内容进行合理拓展，能使课堂教学充满活力、灵性和创造性，发展学生的爱好和特长，让学生想学、乐学，获得可持续性的发展。

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1.2统计学方法应用SPSS17.0进行分析，采用非参数Kraskal-Wallis、Dunnet-t检验、χ2检验和应用生存分析。

2结果

2.1HSP70蛋白的分布与表达HSP70阳性物质呈棕色颗粒状，位于胶质细胞瘤的胞核和胞质中，以灶状或颗粒点状分布，不同病理分级HSP70免疫组化图片，见图1。HSP70在正常脑组织中呈基础分布，HSP70计数值平均为5.60±1.82，各级星形胶质肿瘤细胞中HSP70分布呈逐级上升趋势，经Spearman秩相关分析，肿瘤分级与HSP70分布呈正相关(r=0.685，P＜0.001)，具体分布情况，见表1。以正常脑组织为参照，肿瘤Ⅲ、Ⅳ级脑细胞中HSP70计数值分别为38.11±16.75、55.17±24.96，明显高于正常脑组织(P＜0.01)。肿瘤Ⅰ、Ⅱ级HSP70计数值分别为15.2±7.58、24.38±14.40。

2.2HSP70表达与星形胶质细胞瘤临床病理特点的关系62例星形胶质细胞瘤患者中，21例HSP70表达增高，与正常脑组织有差异(P＜0.05);HSP70表达情况与性别、年龄无关(P＞0.05);胶质瘤Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期中表达阳性率。见表1。

2.3生存率比较随访观察患者5年生存率，HSP70阳性组5年生存率(36.1%)明显低于HSP70阴性组(61.5%)(P=0.029)。生存曲线图，见图2。

3讨论

HSPs是机体应激反应性蛋白质，其作为一种“分子伴侣”参与细胞的生长、分化、基因转录，帮助胞内蛋白折叠、组装和转运，并具备免疫保护作用。在HSPs的大家族中，HSP70为高度保守的ATP酶，在细胞应急或非应急状态下蛋白质的代谢及调控中起重要作用，其表达水平的改变可以反映细胞老化状态，还可以作为判断细胞应激能力和生理状态的指标。除了分子伴侣功能外，HSP70在肿瘤免疫中的重要作用近年来也备受关注。HSP70表达增强往往与肿瘤细胞的低分化、淋巴结转移、肿瘤耐药等密切相关，可能参与肿瘤细胞的某些生物活动;另一方面又能诱导和增强机体抗肿瘤免疫反应，抑制肿瘤生长。研究报道，HSP70参与了肿瘤细胞周期的调控和表型改变，肿瘤细胞的异质性使HSP70在与其相结合时成为肿瘤抗原多肽的靶载体，协助机体免疫系统对抗原肽识别，从而诱导特异性的抗肿瘤免疫反应;HSP70能够与肿瘤细胞内的肿瘤特异性抗原多肽结合形成复合物，通过与巨噬细胞、树突细胞等抗原提呈细胞的表面受体特异的结合而激活特异性抗肿瘤免疫，而主要组织相容性复合体Ⅰ类分子如CD91、CD40、趋化因子、TLR4等参与介导途径。HSP70可通过调整Th1/Th2调整机体免疫状态或直接活化TCRγδT细胞或自然杀伤(NK)细胞参与非特异的抗肿瘤免疫作用。

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1．2肝细胞标志基因的检测按照总RNA提取试剂盒的操作说明分别提取hUC-MSCs和人肝癌细胞HepG2的总RNA，用RNase-FreeDNaseⅠ去除基因组，最后检测RNA的浓度和纯度，立即进行反转录合成cDNA或保存于－80℃备用。采用Prime-ScriptTMⅡHighFidelityRT-PCR试剂盒反转录2μgRNA得cDNA，取2μL用于PCR。根据GenBank提供的人肝细胞标志基因序列，使用PrimerPremier5．0软件设计引物，引物序列和产物大小见表1。GAPDH为内参对照。PCR反应条件:94℃预变性5min;94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸30s，30个循环;最后72℃延伸5min。PCR产物用20g/L的琼脂糖凝胶电泳，在凝胶分析系统下拍照。

1．3PAS糖原染色按照PAS染色试剂盒的说明书操作，对第5代hUC-MSCs和HepG2进行糖原染色，在倒置相差显微镜下观察并照相。

2结果

2．1hUC-MSCs的分离、培养、传代及鉴定组织块贴壁培养3～4d时，可观察到组织块间隙铺展出小三角形或长梭形的细胞，继续培养至7d左右，可观察到局部细胞呈集落生长，此时，在无菌条件下取出组织块，更换新鲜培养基，继续培养1周左右，细胞可达80%～90%汇合，即可传代。用胰酶/EDTA消化后细胞呈亮而圆的单个分散状，以1∶3的比例进行传代，约4h贴壁，2d后迅速生长。倒置相差显微镜下可观察到细胞较大，轮廓清楚，内部有清晰的应力纤维，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显，呈典型的成纤维细胞样形态(图1A);持续培养大约2周时，细胞基本达到完全汇合，形态发生一定的变化，胞质变得狭窄，内部的应力纤维也不明显，呈平行排列或漩涡生长(图1B)。连续多次传代，细胞保持稳定的、相对均一的成纤维细胞样形态以及较强的增殖能力。经鉴定分离培养的细胞CD44呈阳性表达，且具有良好的均质性。

2．2肝细胞标志基因的表达以HepG2作为阳性对照，用RT-PCR检测hUC-MSCs的肝细胞标志基因的表达情况，结果见图2，hUC-MSCs表达ALB、CK18、G6P、GLUL和MET，不表达TAT。

2．3PAS糖原染色结果对hUC-MSCs和HepG2进行PAS糖原染色，染色结果显示两种细胞的细胞质中均有紫色颗粒物形成，即均呈糖原阳性反应(图3)。

3讨论

MSCs能分泌多种细胞因子和生长因子，具有直接或间接的抗炎及抗纤维化作用，可抑制肝细胞的死亡和纤维化;还可通过其分泌物抑制肝细胞的凋亡、刺激肝细胞再生、为受损肝细胞提供营养支持等。MSCs还具有低免疫原性及免疫抑制力，适用于进行同种异体移植，在移植后可迁移、归巢至受损的组织，发挥治疗作用。因此，MSCs在肝脏疾病的细胞移植治疗中具有广阔的应用前景。研究发现，相较不同来源的MSCs，脐带来源的MSCs不仅具有干细胞的特性，而且来源丰富、取材方便、增殖能力较强、无伦理法律限制，还具有较低的免疫原性和分化程度，从而成为一个非常有吸引力的移植治疗肝病的细胞来源。

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2结果与分析

2．1病原菌生物学特性观察

2．1．1温度和pH值影响

试验结果看出，在PDA培养基上槟榔炭疽菌菌丝生长的温度范围是10～40℃，最适生长温度25～30℃，低于5℃或高于40℃均不能正常生长。该菌在15～30℃均能产孢，最适产孢温度25℃，产孢量最多。pH值4～11时槟榔炭疽菌在PDA培养基上均能生长和产孢，菌丝最适生长pH值6～7，pH值大于4的条件适宜产孢，pH值＝6产孢量最大（见表1）。pH值对菌丝生长和产孢的影响一致，酸性偏碱的条件适宜病菌的生长和产孢。

2．1．2不同碳源、氮源的影响

试验结果看出，不同碳源培养基上，槟榔炭疽菌菌落生长及产孢量明显不同。7种供试碳源的菌丝生长均优于对照，除D－半乳糖外，其他碳源的菌落直径均大于对照，说明碳源对槟榔炭疽菌菌丝生长具有促进作用。海藻糖的菌落直径最大，长满整个平板，且菌丝生长旺盛；其次为可溶性淀粉，菌丝生长茂密。碳源对槟榔炭疽菌的产孢量影响差异较大。除可溶性淀粉、D－果糖、甘露醇的产孢量大于对照外，其他供试碳源的产孢量均低于对照。可溶性淀粉的产孢量最大，D－果糖次之。8种供试碳源中，可溶性淀粉适合槟榔炭疽菌生长和产孢，可作为槟榔炭疽菌的培养碳源。不同氮源对槟榔炭疽病菌菌落生长及产孢的影响差别较大。以硝酸钾和脲为氮源时，菌落生长最快，菌丝生长旺盛，且产孢量也最大；硝酸钠培养基的菌落生长旺盛，但不产孢。以硫酸铵、氯化铵、硝酸铵为氮源的菌丝生长及产孢均明显受到抑制。在无氮培养基上，菌落直径最大，但菌丝极少，接近透明且不利于产孢（见表2）。

2．2杀菌剂的抑制作用

试验结果看出，6种杀菌剂对槟榔炭疽病菌菌丝生长的抑制作用差异较大（见表3，图1）。咪鲜胺抑制作用最强，其次为苯甲•丙环唑，代森锰锌、十三吗啉的抑制作用较弱，不适用于防治槟榔炭疽病；甲基托布津、多菌灵对槟榔炭疽菌基本上无抑制作用，不能用于防治槟榔炭疽病。

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2、新时期古生物学的发展机遇

进入21世纪，古生物学的发展迎来前所未有的机遇，这主要表现在以下几个方面：（1）近年来大量新的重要古生物化石材料和信息的发掘和一些新的化石分布规律的揭示，给自然科学领域不断带来新的认识和启示，并且在一定程度上影响和改变了许多重要的传统科学认识．中国古生物学者在这方面的贡献最大．对于中国古生物学在这方面的贡献，国际最具影响力的两个刊物《Nature》和《Science》都曾经给予前所未有的专门归纳和评述，并曾将其中15篇报道和评述集成专辑出版（Gee，2001）．（2）进入21世纪，环境问题已经成为人类生存的最大挑战之一．与当代环境恶化紧密相随的生物多样性剧减，使人们不得不联想到地质历史时期曾经发生过以古生物大灭绝为标志的重大地质事件，因而有学者提出当前我们人类正面临着“第六次大灭绝”（LeakeyandLewin，1996；何卫红等，2004；Barnoskyetal．，2011）．因此“全球变化”已经成为当前最热门的主题，无论在科学领域，还是在政界范围，与生物和人类生存密切相关的环境（以及能源）问题，都已经成为推动或者制约科技进步和国家发展的关键，例如新能源的开发碳减排等．（3）人类只有一个地球，已知的生命也只生活在地球上．随着科技的进步，人类寻找地外生命和外太空生存空间的努力已全面展开．但是经过大量的努力后，到目前为止我们了解到的地外星球只能与我们地球的初期状态进行比较．因此，地球早期生命起源及其拥有的环境条件研究，成为外太空生命探测的指向标．基于地球生命与环境为一体的“GAIA假说”（LovelockandVolk，2003），已经指导了近年来的地外生命和环境探索．（4）古生物化石对于青少年有着极大的吸引力，其对于广大民众来说也是如此．其主要原因是，它们曾经是在地球上生活过的生物，既真实又具体，但绝大多数已经灭绝了．它们的生存及消亡，对于我们人类也具有启示意义．对它们的认识和了解，正是培养青少年科学思维和提升民众科学素质的最有效途径．因而在国家和社会经济发展到一定阶段后，各类以古生物化石为特色的自然历史博物馆大量产生．其不仅是政府行为，用来提升民众的科学素质，而且也有一定的经济和社会效益．同样地，由于化石是不可再生的自然资源，以化石为交易对象的各种正规和非正规的地下市场也活跃起来．（5）尽管当代科技进步发展了许多定年和划分对比地层的新方法，但到目前为止还没有比古生物化石更经济有效而可靠的地层年代确定和划分对比手段．虽然全国1：20万大区域地质调查已经建立了良好的地层格架，但新时期在许多领域的科学研究和实践应用中，仍离不开古生物学的精细研究，如年代地层界线层型GSSP的确定造山带地层学研究精细的矿产地质资源调查与评价等．只是这些工作对于古生物学知识的需求通常更加专业化，且需求量相对有限．（6）21世纪科学发展的新高度，在微观领域，生命科学在微生物等研究方面不断取得新的进展，不仅带动了生命科学的飞跃发展，而且也促进了地微生物学（geomicrobiology）的新生；在宏观领域，地球系统科学中生物圈与地球其他圈层之间的关系是最复杂也最有生命力的部分（孙枢和王成善，2008），它迫切需要从地球历史的角度认识和探索地球生物与环境的协同演化关系和过程，从而给古生物学的发展带来新的机遇．可以说，古生物学的研究领域正在拓宽和深入，并逐步向地球生物学（geobiology）发展．

3、当前古生物学发展面临的挑战

然而，当前的古生物学发展仍然面临着很大的困难和挑战．第一，传统古生物学研究仍在一定程度上存在重理论轻应用的情况．古生物学不仅要重视研究古生物的生物学，包括古生物复原生态恢复生物演化等，而且也要强调古生物的资源和环境效应，如烃源岩的古生物学生物成矿和找矿作用环境微生物和生态修复等．古生物学需要从深化理论研究和拓宽实际应用两方面同时进行努力．第二，虽然人们重视了当代和未来的全球变化研究，但却对过去全球变化未给予应有的重视．我们现今生活的地球只是其数十亿年坎坷演变历史中的一个瞬间，当代人类宜居的环境是生物界与地球环境经过长期相互作用共同演化的产物．因此要正确认识当代人类生活的环境面貌，预测未来的全球变化，就必须解析地质历史时期的生物界及其与地球环境相互作用的历史，以启示人类正确处理当代和未来的人―地关系，才能制定可持续发展的资源和环境利用措施．第三，科技的进步和经济实力的增强，人们迫切地希望飞出地球去开辟新的居住地，而忽视了当前我们的地球环境是地球古生物历尽艰辛长期改造和适应的结果．只有全面理清了我们地球历史上从生命起源，经历无数关键节点的演化飞跃，直到人类诞生的历程及其生存背景条件，才能制定切实可行的各类星际生存空间的探测目标．第四，现有的教育体制在很大程度上限制了中小学生的科学兴趣和科学探索的培养．虽然大多数少年儿童在早年的时候都对化石着迷，并具有探索自然科学的热情，但很快在随后的模式化教育中被扼杀，因为他们的主要精力必须投入到与升学直接相连的应试教育中，不能再有太多时间来发展自己的兴趣了．在一些以商业利益为目的的环境中，化石虽然被作为一件真实的科学珍品而受到广大民众的青睐，但或者由于民众古生物学知识的缺乏，或者由于经营者的利益追求，也或是经营者也缺乏相应的古生物学知识，许多化石常被演绎为一些莫名其妙的“民间传说”，而且“以讹传讹”，误导民众，甚至歪曲科学（廖卉，1998）．更有甚的是，由于地方管理者和民众的古生物学知识的缺乏，在各种利益的驱动下，滥采乱挖，使得一大批不可再生的珍贵化石资源遭到毁灭性的破坏，从而对人类自然科学研究带来不可弥补的损失．第五，受前期行业不景气的影响，有不少人偏见地认为，古生物学在地层研究中已失去作用，因而一些基层单位很不重视古生物地层工作．在某些古生物学相关行业，一些部门和基层领导对古生物学工作重视不够．例如在区调工作中很少布置化石采集鉴定工作量．在许多新区，生物地层工作水平有所下降，而古生物地层工作是需要野外和室内较多的投入和比较专业型的人员才能完成，尤其精细的古生物地层研究更需要耐心和投入，这与当前普遍追求的高效益时代之间存在矛盾，因此古生物学在许多基层单位得不到应有的重视．此外，许多古生物学家也常不易跳出传统古生物学的研究范畴．新时期的古生物学研究，不仅要研究古生物本身，更需要注重借助古生物来研究整个地球，要研究从微观到宏观生物及其作用对象的各个方面．除了与生物直接相关的环境和地球表层系统外，甚至还要通过古生物来示踪地球深部过程或地外事件，例如板块运动超级地幔柱活动外星撞击等事件，因为这些重大事件都会在生物界的发展和适应过程中留下可靠的印记．由此可见，当今古生物学的发展既面临重大机遇，也面临严峻挑战，古生物学教育肩负有重大历史使命．进入21世纪，古生物学的发展已经与科学技术发展和人类文明进步一起进入到一个新的发展阶段，古生物学教育必须与时俱进，跟上科学和社会发展的步伐，探索新的发展途径．

4、古生物学教育的途径

21世纪的古生物学教育必须顺应时代的发展，在3个层次上进行改革探索，即专业的古生物学教育非专业的古生物学教育和普及古生物学教育．其中专业古生物学教育的重点是调整课程设置，适应科学的发展；非专业古生物学教育的关键是改革教学内容，顺应社会经济和建设的需求；而普及古生物学教育的核心是因材施教，培养各类社会服务所需要的人才．

4．1专业古生物学教育

专业教育的目的是要培养从事古生物学科学研究实践应用探索和传承古生物学文化的专门人才，他们肩负有维系和发展古生物学科学的历史重任．20世纪的古生物学经历了从门类古生物学理论古生物学生物地质学的渐进演变历史，顺应了时代的发展（Newell，1987；殷鸿福，1994b；Goodwin，2006）．无论在科学研究还是在实践应用领域中都取得了重要成绩．也使得古生物学的学科体系不断完善科学内涵不断丰富学科地位不断提升，为科学发展和社会进步的贡献力也不断增强．21世纪的古生物学面临新的机遇和挑战．科技进步和人类认识的飞跃，微观领域的地微生物学和宏观领域的地球系统科学的发展，催生了“地球生物学”（geobiology），它是地球科学与生命科学和环境科学的交叉融合领域，其基本内核是从地球历史的角度探索生物与环境的相互作用和协同演化关系（殷鸿福等，2008；童金南等，2010）．由此可见，地球生物学应该是古生物学在新时期的跨跃（谢树成等，2006）．而地球科学生命科学和环境科学又都是新世纪发展最迅猛的龙头学科之一，因此可以预见地球生物学将具有巨大的发展潜力．古生物学的本质是地质学与生物学的交叉结合，因此在传统的古生物学专业教育中，课程的设置和教学内容的安排都特别兼顾了地质学和生物学两方面的核心科学内容．相应地，在新时期的专业古生物学教学改革中，必须对其主干课程进行相应的调整和内容更新，既要引入地球科学生命科学和环境科学领域基础核心课程内容，也要注意吸收这些学科领域的一些新的知识内涵，以满足新兴“地球生物学”科学研究和实践应用所必须具备的知识需求．因此可以认为，调整和重新规划与地球生物学相关课程并更新其教学内容是进行专业古生物学教育的重点．表1摘选了中国地质大学（武汉）（含原北京地质学院和武汉地质学院）几个代表性阶段与古生物学相关的课程设置情况，其基本上反映了各阶段古生物学专业人才培养的特点和知识结构需求．波动比较大的是九十年代以后，当地层古生物专业被撤消之后，中国地质大学（武汉）一直采取的是以地质学专业招生，在大学三年级以后选择专业方向的人才培养方式，即在地质学专业课程中只学习“古生物地史学”（一般为70学时），到后一年半的专业方向学习阶段再选择性地学习一些与古生物学相关的课程并从事古生物地层学的毕业论文工作．进入21世纪后，地质学专业古生物学课程的设置更加简化，在专业化学习阶段通常保留的一般只有“微体古生物学”“地层学”等，但阶段性地探索新增有“化石鉴定技术”“生物地质学”“地球表层学”等具有专业针对性和前沿性的课程．然而，这显然达不到专业古生物学教育的目的，于是古生物学专业人才培养的任务转嫁到了研究生阶段．由于在研究生阶段基础课程的学习不是主要任务，虽然学生可以采取补课的形式来充实基础知识，但缺乏系统性有规划的基础教育，很难达到专业人才培养的目的，因此在很大程度上影响了近年来古生物学专业人才的培养．鉴于此，我们认为专业古生物学人才的培养还必须从本科教育开始，依据当前学科发展现状和趋势，结合当前古生物学专业化方向（地质学专业）的本科教学体制，重新规划古生物学专业课程的设置及教学内容的安排．在课程设置上，传统的古生物学课程仍是必须的，包括普通古生物学地史学古生态学地层学等，但必须增加一些地球生物学交叉学科的基础课程，如普通生物学微生物学环境科学概论环境生态学等，或者将这些必要的基础科学知识融合到本学科的其他基础课程中．鉴于课时总量的控制，除普通生物学外，其他课程可以考虑作为本专业方向的重点选修课，同时还要增加一些古生物学应用专业的主干课程作为重点选修课，以使得本专业学生具备探索古生物学实践应用的基础知识．如果在本科学习阶段能够在这些方面打下良好的基础，再通过研究生阶段的专门科学训练，可望能够培养出具有较好古生物学专业基础，并在科学研究和实践应用等方面做出重要贡献的专业型古生物学人才，从而推动古生物学的科学发展和实践进步．

4．2非专业古生物学教育

非专业古生物学教育主要是针对地学其他专业，甚至相关的生命科学和环境科学专业的学生进行的古生物学基础知识教育，目的是培养学生在科研教育生产和社会实践中能够应用古生物学，运用古生物学知识作为工具，服务于其所在领域的科研或实践活动．非专业古生物学教育针对的教育面最广，也是各界学者从业及讨论最多但一直没有得到比较好地解决的问题之一．一般说来，这方面的古生物学知识教学课程比较单一，即古生物学，或称为古生物学基础古生物学概论等，也有与地史学或地层学合在一起称为古生物地史学或地层学及古生物学等．只有少数与古生物学相近的学科专业有时还增设有其他与古生物学相关的专业课程，如微体古生物学古植物学等．由于这些专业的古生物学课程一般在课时上明显少于地层古生物学专业相应的课程，常规的处理办法就是压缩其教学内容，但保持原课程内容体系．例如对于80学时的地层古生物学专业的古生物学课程，一般要求学生掌握80个左右的“标准化石”，而相应地对于40学时的非地层古生物学专业的古生物学课程，就要求学生掌握40个左右的“标准化石”．这种教学内容的安排在当年以古生物化石作为地层年代确定的主要手段的地质工作中并未受到广泛质疑．但自20世纪后期其就受到明显的争议，也致使许多非古生物学专业同行认为古生物学在其研究中失去了作用．这不仅影响了古生物学的科学地位，而且直接影响到古生物学在实践应用中的潜能开发．由此可见，这方面的古生物学教学内容的改革迫在眉睫．由于当前已不再有地层古生物学专业，极少数学校新开的古生物学专业招生人数十分有限，大部分学校实行的是以地质学专业招生，而在培养的后期进行古生物学专业化本科人才培养．但即使这样，接受古生物学专门教育的人数也十分有限，因此古生物学教育的主体仍是非古生物学专业的学生．当前针对这类学生的古生物学课程一般只有一门“古生物学”或“古生物地史学”，或其他变化名称的课程，也即对于大多数学生的主要古生物学知识传授必须贯穿在这门课程中．因此说非专业古生物学教育的核心是教学内容的改革．多年来，我们一直在探索进行古生物学教学内容的改革，主要也是针对非古生物学的地质类专业学生的古生物学课程内容的优化组织．其基本方案已经体现在近年出版的《古生物学》教材中（童金南和殷鸿福，普通高等教育“十五”国家级规划教材，高等教育出版社，2007）．同时也修编了针对非地质类专业的《古生物地史学概论》教材（杜远生和童金南主编，普通高等教育“十一五”国家级规划教材，中国地质大学出版社，2009）．主要改革精神是5个“强调”，即强调基础理论教学强调科学体系教学强调研究方法教学强调科学应用教学和强调与科学前沿和学科发展结合．改革的目的是，加强基础理论知识培养，使教学内容更加贴近科学前沿和实践应用需求（童金南和殷鸿福，2008，2009）．几年来的教学实践表明，这些改革尝试对于当代科学和实践中古生物学知识的运用起到了积极作用，但仍未达到理想的效果，因此还需要进一步探索．在一次古生物学教育与人才培养研讨会上，一位专家对高校古生物学教学提出一条很值得我们深思的意见．他认为当前形势下高校的古生物学教育应该重点教会学生3个问题，即什么是古生物？古生物能解决什么问题？以及如何研究古生物？显然这最后一个问题主要是针对专业古生物学教育中需要考虑的内容，但前两个问题则是所有古生物学课程教学中的重点．鉴于此，非古生物学专业的古生物学课程内容应该着重于古生物学基础知识和古生物学应用两个方面．由此看来，进一步的古生物学教学内容的改革重点，是要进一步缩减门类古生物学方面的内容，但要大大加强古生物学应用方面的教学内容．从而培养学生认识古生物并能在实际工作中应用古生物学知识的能力．

4．3普及古生物学教育

篇9

2灵活多样，结合临床，增强学生的主观能动性

教学方法的选择应根据不同的认知对象、不同的学科、同一学科的不同内容从而选择不同的方法，但不管采取何种教学方法，关键在于把课上活，充分调动学生参与教学的积极性。因而根据教学内容的不同，我们采取了多种教学方法。如对于细菌的形态和结构这一章节内容，采用直观的多媒体教学可以让学生形象地看到各种细菌的形态、基本结构及特殊结构;在细菌各论部分，选取部分教学单元由学生自主教学。教师事先根据教学目的、教学内容提出授课提纲、学习重点及难点并确定人员分组。小组成员细致分工、相互协作，在课后完成资料素材收集及教学课件的准备。在此期间，教师与学生进行充分沟通，及时为学生排疑解惑，引导学生在教学大纲的框架下安排课堂讲授内容，并传授讲课技巧及注意事项。同时设计《学生自主学习实践评价标准》，由学生从教学内容安排、课件制作、语言表达等多方面互相进行评议、分析和总结，教师最后进行点评总结。这种教学方式一方面活跃了课堂气氛，加深学生对所学知识的理解，增强了学生的团队意识，另一方面也可以让教师在与学生的互动中、从学生独特的视角中发现许多平时不会思索的问题;在学习引起人类疾病的常见病毒这一部分内容时，采取专题讨论方式进行学习。专题讨论式学习由教师提出专题，分组学生在本专题内提出应深入讨论的问题，查资料，作综述，课堂进行讨论。例如“人类免疫缺陷病毒”的讨论式教学，学生提出一系列问题，如HIV－1感染的分子机制及免疫反应、T细胞功能受损的疾病、HIV疫苗的研究等，经过讨论，不仅全面完成了教学内容，而且为学生提供了一次“综述训练”的机会，教学效果令人满意。此外，作为一门与临床学科关系十分紧密的基础课程，我们在教学过程中十分注重微生物学知识的临床应用，采用PBL教学法将临床病例分析引入课堂讨论教学，由病引入菌，菌中解析病，菌病结合，解除病菌。如此，在整个讲授过程中就将病原微生物的生物学特性、致病物质与致病机制、检查及防治原则讲解清楚。

3反映前沿，开阔视野，培养学生创新能力

在教学过程中，既要将教材中最基本、最核心的理论知识传授给学生，为学生自主学习打下坚实的基础，同时要补充一些开拓性、时代性和应用性较强的学科前沿内容。如微生物的耐药性这一章节，我们为学生播放与耐药机制相关的视频和短片，引导学生就微生物耐药机制的产生及防控进行积极的讨论，鼓励学生查阅耐药机制最新的高质量学术论文并就学习心得进行讨论交流，取得了良好的效果。此外，在授课过程中结合教研室老师的科研方向，为学生讲授该领域的研究进展，如人体微生态学与免疫性疾病的相关性研究进展、新出现的传染病病原体、流行性感冒病毒的研究进展等教材中鲜有介绍的前沿动态，从而启迪学生思维，拓宽学生的知识面。同时鼓励学生积极参与教师的科研课题，通过进行科学实验研究进一步激发学生学习微生物学的兴趣及爱好，培养学生发现问题、解决问题的能力和创新能力，全面提高学生综合素质。

篇10

2结果与分析

2.1同源重组pUC18-LR-Kan的构建

用上下游同源臂引物分别从HPsZJ1208野毒株的基因组DNA中扩增得到了Wza基因上游同源臂Wza-UP和下游同源臂Wza-Down(图3泳道1和3)，上游同源臂5'端和下游同源臂3'端端含有USS识别序列，用Kan引物从pET-28质粒扩增得到了Kan基因片段(图3泳道2)；再将3个PCR扩增片以重叠PCR融合成Wza-UP+Kan+Wza-Down外源打靶片段(图3泳道4)。将Wza-UP+Kan+Wza-Down片段克隆入pUC-18质粒构成同源重组质粒pUC18-LR-Kan。经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后验证，得到预期的2684bp同源重组片段和2635bp的线性化质粒pUC18(图4)，外源打靶基因的三个片段测序结果证明没有发生碱基突变。

2.2自然转化法转化

HPs分别用2μg同源重组质粒自然转化HPs的5个不同菌株的感受态菌，经37℃温箱约36~48h培养，其中5个菌株中,ZJ1017、ZJ1208、ZJ1404和ZJ1307菌株在30μg/mLKan-TSA平板上长出菌落(表2)，以组合PCR鉴定(即用Kan引物、Wza引物、同源臂上下游引物Wza-U-F-EcoRⅠ-USS/Wza-D-R-HindⅢ-USS同时鉴定)结果只有ZJ1208的菌落有被鉴定为阳性的(表2,图5A)。将ZJ1208阳性转化子传至第20代提取基因组DNA，再次进行组合PCR验证，结果依然为阳性(图5B)，测序上下游片段和Kan片段正确，以上验证结果表明获得了Wza缺失株，命名为ZJ1208-ΔWza株。

2.3ZJ1208-ΔWza株与野毒株的生物学特性比较

2.3.1菌落形态的比较

将-70℃冻存的ZJ1208-ΔWza缺失株株和ZJ1208野毒株分别涂布在TSA平板上，37℃温箱培养24h后，可见二者均长出半透明，圆润的小菌落(直径约0.5~2mm)；此结果表明与野毒株相比,ZJ1208-ΔWza缺失株的菌落形态并没有发生明显变化(图6)。

2.3.2生长速率的比较

结果如图7所示，在整个生长过程中，ZJ1208野毒株生长速率要快于ZJ1208-ΔWza缺失株，二者都在12h时OD600值达到最大，分别为2.196和1.246；但其差值达到了0.95；ZJ1208野毒株的对数生长期在约10h时结束，而缺失株ZJ1208-ΔWza在培养8h，即提前2个小时结束。二者的活菌数基本都在8~10h间达到最大，但二者每毫升活菌数对数值的差值也在0.4~0.5个数量级之间。在其继续培养之后，二者活菌数均逐渐减少。

2.3.3荚膜染色和形态结构的比较

取对数生长中前期的突变株ZJ1208-ΔWza缺失株株和ZJ1208野毒株进行荚膜染色，显微镜下观察发现，突变株ZJ1208-ΔWza缺失株中存在比例较多的长链状菌体和长杆状菌体，约占总菌数的30%~40%，而ZJ1208野毒株菌体大部分则较短小，松散，单个菌体居多。在荚膜表达量初步比较中发现，ZJ1208-ΔWza缺失株和野毒株菌体周围都可见被染成绿色的荚膜成分存在(图8)。

2.3.4菌体沉降速率比较

将ZJ1208-ΔWza缺失株和ZJ1208野毒株过夜培养的菌液室温静置5h，每隔1h进行观察，2小时后ZJ1208-ΔWza缺失株菌体即可出现肉眼可辨的菌体沉淀，并且随着时间的延长，沉淀越明显；而ZJ1208野毒株菌体在5h未发生沉淀，菌液依然浑浊；此现象与2者OD600变化相符合(图9)。

2.3.5细胞吞噬实验

细菌计数结果表明，1个MOI感染时，ZJ1208野毒株被吞噬的细菌数量为9.25×103，而ZJ1208-ΔWza缺失株为6.95×105，吞噬率分别为0.064%和3.8%；10个MOI感染时，ZJ1208野毒株被吞噬的数量为1.23×105，而ZJ1208-ΔWza缺失株为0.88×106，吞噬率分别为0.085%和0.48%(图10)。说明ZJ1208-ΔWza缺失株比ZJ1208野毒株更容易被PAM所吞噬。

2.3.6小鼠攻毒实验

实验结果表明，ZJ1208野毒株接种的四个组别小鼠都全部死亡，并且随着攻毒剂量的增加，小鼠起始死亡时间随之提前。而ZJ1208-ΔWza缺失株0.3mL接种组未有小鼠死亡，0.5mL组只有一只小鼠死亡，并且死亡时间比同剂量ZJ1208野毒株组的小鼠死亡时间滞后10个小时。ZJ1208-ΔWza缺失株1mL和1.5mL接种组虽然小鼠也全部死亡，但是死亡时间比相同剂量的野毒株ZJ1208组的滞后(表3)。说明将Wza基因缺失后，ZJ1208-ΔWza缺失株对小鼠的毒力相比野毒株ZJ1208有明显下降。

3讨论

构建缺失株在研究微生物生物学特性方面起着举足轻重的作用，但是其转化技术到目前为止还依然不是很成熟;包括多数细菌和真菌在内，其转化方法都具有菌株特异性或其方法本身的不成熟(Juetal.,2012；孙磊等,2005;Xueetal.,1999)；然而HPs更是如此，这也是针对HPs研究中，国内外目前都在努力克服的一个关键性技术难点。Anna(2005)通过自然转化法构建HPs缺失株；Chen(2012)通过构建大肠杆菌-副猪穿梭质粒在电转化副猪嗜血杆菌方面也进行了初步尝试；Zhang等(2012)利用筛选出的天然感受态副猪嗜血杆菌通过自然转化成功获得ompP2缺失株；申果(2013)也通过自然转化成功构建了cdt基因缺失突等。在本实验构建HPsWza基因缺失株的实验过程中，针对筛选的5个HPs菌株，除了对自然转化方法的尝试和优化外，本实验室前后亦对电转化方法进行了摸索和尝试，但最终未能够用电转化方法获得阳性缺失株；采用自然转化法也是仅仅成功构建了ZJ1208HPs菌株，其他4个菌株中3个虽在Kan抗性平板可以长出菌落，但都没能获得阳性缺失株，以上也印证了HPs转化方法的不成熟和HPs菌株缺失株难以被构建的现象。目前推测限制修饰系统可能是副猪嗜血杆菌转化效率低下的一个关键因素。限制修饰系统最初在大肠杆菌中被发现，其分为4种类型(Robertsetal.,2009)，每种类型由一种限制性内切酶和对应的一种甲基化酶组成；不同的菌属或菌株可能又会存在酶结构上的差异性(Tombetal.,1997)。几乎90%的细菌包含限制修饰系统，而且43%的细菌存在以上4种或更多的限制修饰系统(Robertsetal.,2004)；。Ando等(2000)从分子机制水平验证了幽门螺杆菌的限制修饰系统对质粒的转化和重组起着阻碍的作用。因此，在前期电转方法的尝试中，根据Donahue等(2000)的方法，本实验室亦尝试利用无细胞抽提物(cellfreeextracts,CFEs)先预处理质粒，然后再转化副猪，但并没有取得成功。并且质粒在被CFEs处理回收后，有大量质粒被降解，条件的优化并不能抑制质粒的降解；另外，人们也通过预先确定受体菌中的限制修饰系统所包含的甲基化酶的种类，从而用商品化相应的甲基化酶在试管中预先处理，再转化受体菌，从而证明也可以提高外来质粒的转化效率(Kimetal.,2010)。基于以上经验，笔者认为应该先从基因水平上确定副猪嗜血杆菌的限制修饰系统的种类，然后有针对性的利用甲基化酶来修饰重组质粒，无论是针对自杀质粒或是穿梭质粒，或许此方式可提高自然转化和电转化的转化效率。荚膜合成基因在大肠杆菌和其他菌属已被鉴定出，由于其外膜合成基因和蛋白空间构象具有保守性，华中农业大学通过对HPs基因进行测序，并将其与其他菌科的相关基因和蛋白进行序列和空间构象对比，获得了HPs相关的基因序列功能，同时荚膜合成相关基因亦被鉴定出来，其中在HPs中被鉴定出的Wza基因被推测具有荚膜多糖运输功能(Xuetal.,2011)。因此，本实验通过构建HPs的Wza基因缺失株，一方面来研究证实Wza在HPs中的功能，另一方面来研究荚膜在HPs毒力和致病性中的作用。从本次实验结果来看，ZJ1208菌株至少在体外培养时，野毒株和Wza缺失株都可形成较薄的荚膜，并不能在光学显微镜下看到明显差异；或许其原因可能存在除Wza基因外其他有关荚膜合成的代偿代谢途径，另外ZJ1208-ΔWza缺失株在室温静置可形成菌体沉淀，而ZJ1208野毒株不能，并且在静止时其OD600在1~2h稍有增长，随后平稳，说明ZJ1208野毒株在短时间静置时有菌体进行了分裂繁殖，且不形成沉淀。Cheng等(2010)对肺炎杆菌的一种粘液蛋白合成基因rmpA缺失后，菌体K2荚膜合成减少，从而导致菌体粘度降低，低速离心时，rmpA缺失株可以在试管形成沉淀而野毒株不形成沉淀，并且缺失株对小鼠的毒力亦降低；因此作者推测，ZJ1208的Wza基因亦只对HPs荚膜合成中的一种或几种粘性多糖的运输或合成起着关键性作用，但并不在菌体荚膜的所有多糖的运输或合成中起着关键性作用。另一方面，通过对ZJ1208-ΔWza缺失株株和ZJ1208野毒株的菌落形态，荚膜染色菌体形态,生长速率以及抗PAM吞噬能力大小和对小鼠毒力等生物学特性的初步比较和分析后，发现其二者的菌落形态并没有明显的差异，ZJ1208-ΔWza株生长速率相比起ZJ1208野生株表现的明显较慢，作者认为可能是缺失株在菌体荚膜形成过程中的异常从而使其对培养环境相较于野毒株表现的更敏感和脆弱，使其活菌死亡或是裂解的快，亦或是缺失株本身在生物代谢上的异常从而造成了其生长的缓慢；另外，在8-~10h间，活菌数达到最大，这与OD600变化并不一致，原因可能是菌体死亡速率与二分裂的速率基本持平，但ZJ1208-ΔWza株菌体比起ZJ1208野生株菌体裂解的更快，因此可以看到对数生长曲线中ZJ1208野生株在8~10h后仍然在攀升,而ZJ1208-ΔWza株已基本保持平行状态，，这从另一方面也验证了作者对缺失株对培养环境相较于野毒株表现的更敏感和脆弱这一推测；同时，缺失株中较长的菌体比例明显增加，可能原因是其生长缓慢，造成了菌体二分裂的周期延长和缓慢，从而使菌体与菌体之间连接在一起，最终形成了看似较长的菌体；在抗PAM吞噬实验中，相同MOI情况下，PAM对ZJ1208-ΔWza的吞噬能力显著高于ZJ1208野生株，尤其在MOI为1并作用1h的情况下，二者的差异尤为显著；另外，在MOI增加时，野生株ZJ1208被PAM吞噬的数量亦成明显增长，但ZJ1208-ΔWza株被吞噬的数量却增加的幅度较小，甚至不明显；其可能原因是在MOI为1，菌体与PAM相互作用1h的情况下，PAM对ZJ1208-ΔWza菌体的吞噬几乎到达饱和状态，因此在增加菌体数量时，一定数量的PAM亦不能更高效地对其进行吞噬，而野生株ZJ1208菌体相比较ZJ1208-ΔWza，其对PAM不敏感，PAM对野生株ZJ1208吞噬的效率并不高，此时增加菌体数量时，可以较线性的增加PAM对ZJ1208的吞噬数量。小鼠的毒力实验亦表明了ZJ1208-ΔWza和野生株ZJ1208的毒力存在明显的差异，其在0.3和0.5mL组表现得尤为明显。

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2循环分子标志物

鉴于TKI的药理机制，研究者对血浆中可溶性配体（包括VEGF家族和胎盘生长因子placentalgrowthfactor，PlGF）、可溶性受体（sVEGFR－1、sVEGFR－2和sVEGFR－3）的水平进行了检测。研究显示，血浆中这些配体和受体的基线水平和用药后浓度的变化可以作为评估TKI治疗的潜在的生物标志物。RINI等［14］首次报道了基线sVEGFR－3和VEGF－C的水平可能是舒尼替尼治疗晚期肾癌的预后因素，以及可以预测客观反应率。患者血浆中VEGF－A和PlGF水平在舒尼替尼治疗28d后比基线值增加2．8（0．4～13．6）倍和3．9（0．8～20．4）倍，而sVEGFR－3水平下降平均37．6％。PORTA等［15］研究了85例患者舒尼替尼治疗和基线血清VEGF－A水平之间的关联。在这项研究中，VEGF－A基线水平较高的患者PFS期较短（OR：2．14，95％CI：1．324～3．459）。报告称，VEGF－A升高的患者中位PFS为4．7个月（95％CI：2．8～8．3），无VEGF－A升高的患者中位PFS的为11．2个月（95％CI：6．5～15）。DEPRIMO等［16］报道了肿瘤对药物客观反映良好的患者与疾病稳定或疾病恶化患者对比，血浆VEGF、sVEGFR－2和sVEGFR－3的水平显著变化（P＜0．05）。此外，舒尼替尼和其活性代谢产物SU12662的总药物谷值浓度与平均sVEGFR－2和sVEGFR－3的基线血浆水平呈正相关［16］。索拉非尼治疗肾细胞癌的三期临床试验（treatmentapproa－chesinrenalcancerglobalevaluationtrial，TAR－GET）对血浆蛋白VEGF、sVEGFR－2、CAIX、金属蛋白酶－1组织抑制剂（tissueinhibitorofmetalloprotei－nase－1，TIMP－1））进行了分析。在这个研究中，索拉非尼治疗后也观察到类似于舒尼替尼相对应的VEGF和sVEGFR－2的变化，升高的血浆TIMP－1是一个独立的不良预后因素［17］。这些血管生成相关蛋白的变化倍数可能是TKI治疗晚期肾癌潜在的分子标志物。

3循环内皮细胞

在血管形成过程中，除了可溶性蛋白，还有骨髓来源的循环内皮前体细胞（circulatingendothelialprogenitors，CEP）和循环内皮细胞（circulatingendo－thelialcell，CEC）的数量也会增加。GRUENWALD等［18］报道称，PFS高于中位值的患者，CEC值在第28天时较基线值显著增加［（111±61）CEC／mLvs．（40±41）CEC／mL，P＝0．0109］；而PFS低于中位数的患者CEC上升不明显平均值［（69±61）CEC／mLvs．（53±45）CEC／mL，P＝0．1848］。FARACE等［19］报道，在TKI治疗的患者中，CEC基线值与PFS或总生存期（overallsurvival，OS）无关，但循环内皮祖细胞的基线值与PFS（P＝0．01）和OS（P＝0．006）相关。另外，在治疗第1天与第14天循环内皮祖细胞的变化与PFS（P＝0．03）有关。CEP和CEC在肿瘤血管生成中也扮演着不可或缺的一部分，并且可能是血管生成抑制剂治疗合适的预测预后的生物标志物。

4单核苷酸多态性

研究显示单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）可以作为预后的潜在生物标志物，尤其是在涉及到TKI药效学或药代动力学相关的基因和促血管生成途径的基因。在帕唑帕尼治疗肾细胞癌的III期临床试验，XU等［20］报道称，IL8、HIF1α的三个SNPs，HIF1α、NR1I2（nuclearrecep－torsubfamily1，groupI，member2）和VEGFA的5个SNPs分别与PFS和有效率相关，并认为药效学因素可以预测帕唑帕尼单药治疗肾癌患者的反应。GARCIA－DONAS等［9］报告称，VEGFR－3的2个SNPs（rs307826、rs307821）与反应率和生存率相关。另外，还有多个SNPs与预后相关，如VEGF－A的rs833061、rs2010963位点多态性［20－21］。4个VEG－FR－1位点多态性与反应率和生存率相关［22］。与TKI药代动力学相关的多个基因如ABCB1（ATP－bindingcassette，sub－familyB，member1）、CYP3A5（cytochromeP450，family3，subfamilyA，poly－peptide5）的多个SNPs与PFS有关［23－24］。

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2、将生物学科教学与低碳生活相关知识相融合的改进方法

2.1将低碳生活理念与生物教学内容有机结合

从生物学科的教材内容上看,教材原有的各类动物、植物的知识已经涵盖了一部分低碳生活的要素,教师应该根据现有的教学内容进行改进,适当突出含有低碳生活知识的部分、紧跟新闻时事,根据学生的兴趣使生物教学更加系统化与层次化。例如在生物与环境章节融入环境对生物物种生长发育及分布的影响、生态环境危机及低碳发展的相关理论,在现代生物技术等题教学中组织学生到污水处理厂进行参观,在直观见证现代污水生物处理技术应用的同时培养其节能节水的低碳行为。此外,在教学实践中,组织学生搜集低碳素材,设计低碳生活闷卷并在校园一定区域内进行问卷调查社会实践。同时,制作低碳牛活宣课件进行校吲内低碳宣教。这些低碳教程的合理渗透取得了较好的效果。

2.2让生物学科的理论知识运用到实践中

生物学科的教学目标是让学生了解相关知识,并且能够在实际生活中运用这些知识解决困难,为今后更深一层的学习打下良好的基础。面对我国当前经济发展的态势重视环保工作也非常重要,因此让学生领会多姿多彩的生物界的同时还要了解很多环境保护的知识,这些理论知识可以帮助他们了解自然,热爱自然。而且还要让他们理解低碳生活,低碳经济。了解人类的索取会给自己和其他生物带来什么样的后果。生物世界是很奇妙的,生物种类繁多,包括植物、动物、微生物。这些知识在教材中都有详细的讲解。生物和他们所拥有的基因已及与它们生存的环境形成了现在这个高耗能经济,这种经济发展造成无序的抛弃、污染、垃圾、核废料正成为地球生态向前延续的巨大障碍。在理论知识的讲解中多与实践相联系,可以组织学生认识常见的动植物,试着给它们分类,了解它们的习性,收集标本都可以让学生学会如何和身边的生物相处,让他们学会尊重生命。保护地球。

2.3利用多媒体的现代化技术平台提高教学水平

在信息技术飞速发展的时代中,将计算机多媒体平台作为生物知识的教学平台可以大大提高教学效率,提升学生的学习兴趣。多媒体平台拥有的动画、声音、图片等媒介能让生物学知识呈现出更生动立体的面貌。这些媒介都有助于让生物知识在学生脑海中留下更深刻的形象,有助于提升学生的学习主动性。教师在生物学课件的制作中,应该充分考虑到这些因素,将大纲上的知识难点深入浅出地通过多媒体教学平台传授给学生,这种教学方式比传统挂图、板书等教育手段减少了众多弊端。如基础理论的很多微观知识点晦涩难解,因此这部分知识尤其注重动画、声像、影视等多媒体技术及资源的利用。实践证明,通过动画显示显微镜下的中期细胞中的全套染色体的多媒体教学方式可以取得较好效果。实践证明,利用多媒体技术和声像教学法不仅可以让学生快捷,轻易地掌握理论知识,还恰好切合了低碳环保的教学理念,有效降低教学资源的浪费。