分子生物学论文范文

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1.2实验材料

1.2.1蜱的来源2013年4－5月，从伊宁县的2个采集点、2个绵羊群，每群＞30只，均未药浴，采集其体表寄生蜱，共获得硬蜱324只，放置于潮湿阴暗处，以保持其存活。

1.2.2主要试剂PCR所用试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司；DNA提取试剂盒（DNeasyBloodTissueKit）购自德国Qiagen公司；其他试剂均为分析纯。

1.3实验方法

1.3.1蜱种鉴定参照《中国经济昆虫志》［9］，用普通解剖显微镜将324只蜱进行形态学鉴定，初步分类后，从中选取50只用配备数码照相功能的解剖显微镜（LEICAM165C）拍摄图片，对蜱的盾板、假头、假头基、肛侧板、气门板、第一缘垛、孔区（雌蜱）等形态进行对比观察并测量［11］。1.3.2蜱的处理和DNA提取将蜱标本分别依次用浓度为70%、50%、30%、10%的乙醇溶液于37℃摇床中振荡冲洗1h，再用超纯水反复冲洗，干燥。最后置于消毒灭菌的1.5mlEP管中。按照DNA提取试剂盒使用说明书提取虫体基因组DNA，置-20℃保存备用。

1.3.3基因扩增用上游引物5′-CTGCTCAATGATTTTTTAAATTGCTGTGG-3′，下游引物5′-CCGGTCTGAACTCAGATCAAGT-3′扩增线粒体16SrRNA序列［12］；上游引物5′-CAAAAWCCTGGTAAAATTAAA-3′和下游引物5′-GCACTATCAAGCAACACGACT-3′扩增COⅠ序列［10］。25μlPCR反应体系：模板1.5μl（约50ng），上游和下游引物各0.75μl（75pmol），50mmol/LKCl，10mmol/LTris⁃HCl（pH8.3），1.5mmol/LMgCl2，1单位TaqDNA聚合酶。PCR反应循环参数为：①16SrRNA为94℃预变性5min，92℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共38个循环，72℃终延伸8min。②COⅠ为94℃预变性5min，92℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸60s，共38个循环，72℃终延伸8min。扩增片段后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。1.3.4序列分析及系统进化树构建结合GenBank登录的图兰扇头蜱的16SrRNA和COⅠ参考序列，将本实验PCR扩增的6条16SrRNA及6条COⅠ序列测序结果与参考序列比对，运用Mega5.0软件的ClustalX程序分析，计算遗传距离并构建遗传进化树。

2结果

2.1蜱种鉴定所鉴定蜱共324只（168、156），虫体体型较小，雌虫体长3.2～5.5mm，雄虫体长2.9～3.6mm，呈褐色，背腹扁平似卵圆形，芝麻至米粒大，雌蜱饱血后可膨胀达蓖麻籽大。体分为假头和躯体两个主要部分（图1A）。假头基呈六角形，侧角明显，后缘微凹（图1B）。雄蜱盾板覆盖整个背部，雌蜱盾板覆盖背前部，前部较窄，后部圆钝，盾板遍布刻点，以细刻点居多，粗刻点少而零散（图1C）。眼卵圆，靠近盾板前部边缘。须肢粗短，中部最宽，前端稍窄。雄蜱气门板长卵形（图1D）。体端有缘垛，中垛大于边垛，常有尾突（图1E）。有肛沟，雄性肛侧板后缘内斜明显，内缘具角突，长约为宽的2.5～3.0倍，内缘中部稍凹，后缘向内显著倾斜，其后方凸角明显（图1F）。结合有关文献［9，13］认为伊宁县的蜱具有硬蜱科扇头蜱属图兰扇头蜱的特征。但由于吸血、饱血雌蜱及部分未成熟或形态变异的雄蜱，仅用传统形态学分类方法不能准确区分。因此，从324只中选出6只雌雄分别具有形态差异的蜱（4、2），根据采集地点分别将其命名为YN-1、YN-2、YN-3、YN-4、YN-5和YN-6。YN-1为当地典型雄性图兰扇头蜱；YN-2和YN-3为半饱血雌蜱，因其腹部吸血膨胀已无法观察缘垛，肛侧板和副肛侧板难以区分形态且边界不清；YN-4、YN-5和YN-6为部分形态特征改变雄蜱，YN4和YN5体端较宽似倒置三角形与典型的图兰扇头蜱卵圆形体端不同，且YN5气门板呈长逗点形与血红扇头蜱气门板相似；YN6肛侧板后缘圆钝，凸角不明显。因此对这6只蜱采用分子生物学方法进一步分析，对上述形态学鉴定结果进一步验证。

2.2分子生物学鉴定

2.2.1PCR扩增通过PCR扩增上述形态学差异较大的6只图兰扇头蜱线粒体DNA，产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，均获得特异性很好的PCR产物，与预期目的片段一致（16SrRNA约为460bp，COⅠ约为760bp）。

2.2.2图兰扇头蜱16SrRNA和COⅠ基因片段组成利用Mega5.0软件计算6只图兰扇头蜱的16SrRNA和COⅠ基因片段碱基组成。16SrRNA基因片段A、T、C、G的平均碱基含量分别为36.68%、37.12%、10.7%和15.5%，碱基A＋T平均含量是73.78%。COⅠ基因片段A、T、C、G的平均碱基含量分别为38.56%、31.78%、14.12%和15.54%，碱基A＋T平均含量是70.34%。

2.2.3图兰扇头蜱基因序列比对及系统进化树运用Mega5.0软件的ClustalX程序进行多重序列比对后，16SrRNA获得2种不同序列，并登录GenBank，登录号分别为KF547987和KF547989；COⅠ获得3种不同序列，登录号分别为KF688136、KF688137和KF688138。各结合GenBank登录的3种扇头蜱的参考序列构建系统进化树。6只图兰扇头蜱16SrRNA基因片段的遗传变异很小，共检测出2个单倍型，1个变异位点。其中YN-2、YN-3、YN-4和YN-5序列相同，为一种单倍型；YN-1、YN-6在216位点处为转换位点（T-C），为一种单倍型。基因序列比较结果显示同源性均在99.5%以上，遗传距离为0.3%～0.5%。而上述6只图兰扇头蜱的COⅠ基因片段序列变异较大，共检测出3个单倍型，4个变异位点。YN-1、YN-2和YN-6序列相同，为一种单倍型；YN-3和YN-5检测到3个变异位点，均为转换位点（A-G），无插入/缺失和颠换现象；YN-4在上述变异基础上，于574位点处发生转换（A-G）。基因序列比较结果显示同源性均在98.6%以上，遗传距离为0.3%～1.9%。

篇2

1.利用APAGE、荧光原位杂交技术（FISH）、PCR和RFLP标记，对导入黑麦多小穗等性状创制的小麦新种质‘10-A’进行了分子检测。APAGE分析发现，‘10-A’与其他T1BL.1RS易位系一样，含有黑麦1RS的醇溶蛋白标记位点Gld1B3。用黑麦1RS的特异性PCR引物对‘10-A’的基因组DNA进行扩增，发现其也具有黑麦的1RS染色体。以黑麦基因组总DNA作探针，用中国春基因组DNA做封阻，与‘10-A’根尖细胞有丝分裂染色体进行荧光原位杂交，结果表明黑麦1R染色体的整个短臂（1RS）易位到‘10-A’中。用25个RFLP标记进行Southern分析，进一步发现10-A的1特异性限制片段发生丢失，代之以黑麦1RS的特异性限制片段，而位于其他染色体上的特异性限制片段未发生缺失。FISH和RFLP标记同时表明，‘10-A’中没有小麦4A-黑麦4R染色体易位。据此认为，多小穗小麦新种质‘10-A’属于T1BL.1RS易位系。同时，本研究还对‘10-A’的多小穗改良系进行了分子检测，发现他们均具有T1BL.1RS易位染色体。

2.对几种鉴定小麦背景中的T1BL.1RS易位染色体的常规方法和分子标记方法进行比较发现，APAGE方法是一种快速有效的方法，最易于在小麦育种选择中应用。

3.以来源于多小穗小麦新种质‘10-A’、普通穗型小麦品系88-1643和川育12号组配的三交组合‘10-A’/88-1643//川育12号的重组系为供试材料，选用4个RFLP标记和1个醇溶蛋白标记Gld1B3分析了T1BL.1RS易位染色体对农艺性状和籽粒蛋白质含量、及其性状间的简单相关和偏相关的影响。结果表明，T1BL.1RS易位[文秘站:]染色体对小麦小穗数、每小穗结实粒数、千粒重、穗粒重、株高和籽粒蛋白质含量等几个性状具有显著的影响，而对穗粒数和抽穗期的影响不大。T1BL.1RS易位系的平均小穗数、千粒重、穗粒重、株高和籽粒蛋白质含量分别比非易位系高5.0、4.6、6.4、5.7和6.8，而平均每小穗结实粒数则低6.9。从农艺性状间的简单相关和偏相关系数来看，一些性状间的显著简单或偏相关关系仅T1BL.1RS易位系群体中检测到，而另一些性状间的显著简单或偏相关关系仅在非易位系群体间检测到。同时，一些性状间的简单相关系数在易位系和非易位系群体间的差异性达到显著或极显著水平。这些结果表明，T1BL.1RS易位染色体不仅对小麦农艺性状和籽粒蛋白质含量具有显著的效应，而且对性状间简单相关和偏相关的程度和性质均有一定的影响。

4.利用APAGE和SDS-PAGE技术对四川白麦子地方品种、云南铁壳麦、半野生小麦和新疆稻麦的醇溶蛋白和高分子谷蛋白亚基进行了分析。结果发现，在89份四川白麦子地方品种中，共出现35种醇溶蛋白带型和3种高分子谷蛋白亚基组合，其中2份小麦地方品种的醇溶蛋白带型和87份小麦地方品种的高分子谷蛋白亚基组合与‘中国春’一致。在14份云南铁壳麦中，出现了8种醇溶蛋白带型和3种高分子谷蛋白亚基组合。在9份半野生小麦中，出现了9种醇溶蛋白带型和4种高分子谷蛋白亚基组合。在9份新疆稻麦中，出现9种醇溶蛋白带型和5种高分子谷蛋白亚基，其中1份材料具有Glu-D1编码的新亚基2.1 10.1。从醇溶蛋白和高分子谷蛋白亚基表型来看，新疆稻麦和半野生小麦的醇溶蛋白和高分子谷蛋白亚基变异最高，其次为云南铁壳麦，而四川白麦子小麦地方品种的醇溶蛋白和高分子谷蛋白亚基变异则最低。

5.根据醇溶蛋白APAGE图谱和高分子谷蛋白亚基SDS-PAGE图谱，研究了四川白麦子地方品种、云南铁壳麦、半野生小麦和新疆稻麦的Gli-1、Gli-2和Glu-1位点的等位基因变异频率。在89份四川白麦子地方品种、14份云南铁壳麦、9份半野生小麦和9份新疆稻麦的Gli-1位点上，分别发现14、10、14和11个等位基因；在Gli-2位点上，分别发现15、9、13和12个等位基因；而在Glu-D1位点上，则分别出现了5、5、6和8个等位基因。从等位基因出现的频率来看，新疆稻麦和半野生小麦的等位基因变异频率远远高于云南铁壳麦和四川白麦子。从不同基因位点来看，Glu-1位点的等位变异又低于Gli-1和Gli-2位点的等位变异。

6.根据Gli-1、Gli-2和Glu-1位点的等位变异频率计算四种小麦地方品种群体内的Nei’s遗传变异系数。在四川白麦子、云南铁壳麦、半野生小麦和新疆稻麦的平均Nei’s遗传变异系数分别为0.3706、0.3798、0.5543和0.5693，表明半野生小麦和新疆稻麦的种子贮藏蛋白基因的遗传多样性高于四川白麦子和云南铁壳麦。从醇溶蛋白位点和高分子谷蛋白位点的遗传多样性来看，这4种小麦地方品种的Gli-1和Gli-2位点的平均遗传变异系数分别为0.5486、0.6632、0.7161和0.6770，而Glu-1位点的平均遗传变异系数则分别为0.0148、0.1777、0.2305和0.3540，远远低于前者，说明醇溶蛋白位点的遗传多样性远远高于高分子谷蛋白位点的遗传多样性。从染色体组来看，位于B染色体组的Gli-B1、Gli-B2和Glu-B1位点的遗传变异系数又高于A、D染色体组相应位点的遗传变异系数，表明B染色体组的遗传变异高于A、D染色体组。

7.利用Glu-Ax、Glu-Bx、Glu-A3、Glu-B3和Glu-1Dx5的特异性PCR引物，和位于1染色体上的γ-醇溶蛋白和低分子谷蛋白2对R标记，通过PCR的方法研究了8份四川白麦子、14份云南铁壳麦、9份半野生小麦和9份新疆稻麦贮藏蛋白基因的遗传多样性。结果表明，Glu-Ax、Glu-Bx、Glu-A3和Glu-B3等4个位点的遗传多样性较低，而γ-醇溶蛋白和低分子谷蛋白2个R位点的遗传多样性较高。所有40份供试材料均未扩增出Glu-1Dx5基因的特异DN段，说明这些小麦地方品种不含5亚基的编码基因。

8.利用14个STS-PCR的28种引物-酶组合和24个R标记对四川白麦子、云南铁壳麦、半野生小麦和新疆稻等4种中国特有小麦地方品种群体间和群体内的遗传多样性进行了研究。在供试的40份材料中，11对STS-PCR引物（78.6）的16种引物-酶组合（57.1）能揭示材料间的遗传多样性。在28种STS引物-酶组合中，共获得121条扩增DN段，其中32.7的片段具有多态性。在24个R位点上，21个位点（87.5 ）能够揭示材料间的多态性。在40份材料中，共检测到83个R等位变异，平均每个位点为3.46个等位变异。

9.根据STS-PCR和R标记的多态性，计算了材料间的Nei’s遗传相似系数，并采用UPGMA方法对其进行遗传聚类。结果发现，STS-PCR和R标记揭示的4种特有小麦地方品种群体内的遗传相似性均一致地表明四川白麦子和云南铁壳麦的群体内遗传相似性较高，而半野生小麦和新疆稻麦群体内的遗传相似性较低。这说明新疆稻麦和半野生小麦群体内的遗传多样性较高，而四川白麦子和云南铁壳麦群体内的遗传多样性较低。同时，STS-PCR和R标记均能将所有40份材料相互区分开。从4种小麦地方品种间的遗传关系来看，新疆稻麦与其它3种小麦地方品种间遗传分化较大，单独聚为1类；而四川白麦子和云南铁壳麦间的遗传关系较近，但部分半野生小麦也与云南铁壳麦间具有较近的遗传关系。从R标记和STS-PCR标记揭示的群体间和群体内遗传相似系数的大小来看，与STS-PCR标记相比，R标记在材料间的多态性更高，能够揭示更多的遗传差异。

10.在本研究中，从种子贮藏蛋白来看，‘中国春’与‘成都光头’的醇溶蛋白带型和高分子谷蛋白亚基组合完全一致。从STS-PCR和R标记揭示的遗传关系来看，‘中国春’与‘成都光头’间的遗传相似性最高。这些结果进一步证实‘中国春’是‘成都光头’的一个选系。

11.利用R标记对来源于贵州、云南和四川的8份高抗赤霉病小麦地方品种和4份高感赤霉病小麦材料间的遗传多样性进行了研究。在小麦21条染色体的25个R位点上，共检测到74个等位变异，平均2.96个；其中21个位点（84）能够揭示材料间的多态性。根据R标记揭示的遗传相似性来看，虽然高抗赤霉病小麦地方品种间以及它们与高感材料‘中国春’间的遗传相似性较高、遗传多样性低，但是它们与高感赤霉病的人工合成双二倍体‘R’和意大利小麦品种‘阿勃’间具有相当高的遗传多样性。这些结果表明，可利用高抗赤霉病的小麦地方品种与高感赤霉病的人工合成双二倍体‘R’或意大利小麦品种‘阿勃’之间杂交，构建分子标记遗传分析群体，以标记其中的抗赤霉病基因。

关键词：小麦，黑麦，地方品种，赤霉病，多小穗，农艺性状，蛋白质，遗传多样性，APAGE，SDS-PAGE，FISH，RFLP，STS-PCR，R

TheMolecularBiologyofSomeecialWheatGermplasms

Atract

Wheat(TriticumasetivumL.)isoneofthemostimportantcroinworld.Astheothercrop,thegeneticdiversityofcultivatedwheathasbeengreatlyerodedbythefrequentuseofsameparentalgenotypesforbreedingcultivars.Geneticerosionnotonlylimitsthefurtherimprovementofyieldandqualitybutalsomakeswheatincreasinglyvulnerabletobiologicalandenvironmentalstre.Althoughtherearemanygoodgenesfortheimprovementofwheatintherelatedwildecies,theintroductionofthesegenesfromwildicestocultivatedwheatneedsomeecialcytogeneticmanipulatio.Themoderncultivarsandlandracesaretheprimarygenepoolofcultivatedwheat.Therealsohadmanygoodgenesforwheatimprovementintheprimarygenepool,andnoecialcytogeneticmanipulationwasnecearytotrafergenesfromtheprimarygenepooltocultivatedwheat.Thus,itisanimportantworktoevaluatethegeneticdiversityoftheseresources.Themolecularbiologytechniquesmakeitispoibletoevaluatethegeneticdiversityamongthewheatgermplsmsindetail.Theobjectivesofthisstudyweretodetecttheryechromatininthebackgroundofanewmultiikeletwheatgermplasm10-Aandtheeffectsofthisryechromatinontheperformanceofagronomiccharacters,todescribethegeneticvariatioofseedstorageproteingenesintheChineseendemicwheatlandraces,toevaluatethegeneticdiversityandgeneticrelatiohiamongtheChineseendemicwheatlandraces,andtoinvestigatethegeneticdiversityamongsomeChineselandraceshighlyresistanttoheadscabbyusingAPAGE,SDS-PAGE,FISH,RFLP,STS-PCRandRmarkers.Themainresultsweredescribedasfollowings:

1.UsingAPAGE,FISH,PCRandRFLPmarkers,theryechromatininthebackgroundofanewmultiikeletwheatgermplasm10-Awasdetected.APAGEanalysisindicatedthatthe10-ApoeedthegliadinmarkersGld1B3of1RS.PCRanalysisindicatedthatthe10-Aalsopoeedthe1RSofrye.UsingfluorescencelabeledtotalgenomicDNAofryeasprobesandcommonwheatgenomicDNAofChineseringforblocking,insituhybridizationshowedthatthe1RSofryewastraferredtomultisikeletwheatline10-A.Therestrictionfragmentslocatedontheshortarmofchromosome1Bweremiingandtherestrictionfragmentsof1RSwerepresentwhentheprobes,whichhavebeenidentifiedontheshortarmofthehomologousgroup1,wereusedinRFLPanalysis.FISHandRFLPanalysisindicatedthe10-Adidnotpoethe4A-4Rwheat-ryetralocationchromosome.Theseresultssuggestedthatthemultiikeletwheatline10-AcarriedtheT1BL.1RSwheat-ryetralocationchromosome.Inthisstudy,somerecombinantswithmultiikeletderivedfromatriplecro,10-A/88-1643//Chuanyu12,werealsodetected.AllofthemalsopoetheT1Bl.1RStralocationchromosome.

2.AcomparisonofsomenormalandmolecularmethodsforidentifyingandsurveyingthepresenceofT1BL.1RStralocationinwheatwasconducted.TheresultindicatedthatAPAGEistheeasiestan doftenfasterforscreeningpurposesinwheatbreeding.

3.TheeffectsofT1BL.1RStralocationchromosomeontheperformanceofagronomiccharacters,thegrainproteincontent,andthesimpleandpartialcorrelationcoefficientsamongcharacterswereinvestigatedwith4RFLPmarkersand1gliadinlocusGld1B3inrecombinantsderivedfromatriplecro,10-A/88-1643//Chanyu12.TheT1BL.1RStralocationchromosomehadsignificenteffectsonikeletnumberperike,graiperikelet,1000-grainweight,graiweightperike,plantheightandgrainproteincontent,whilenosignificenteffectsongraiperikeandheadingdatewasdetected.TheT1BL.1RStralocationlinesresultedin5.0,4.6,6.4,5.7and6.8increaseinikeletnumber,1000-grainweight,graiweightperike,plantheightandgrainproteincontentthanthenon-T1BL.1RStralocationlines,reectively.AndtheT1BL.1RStralocationlinesresultedina6.9decreaseingraiperikeletthan1Bgenotypes.SomesignificentsimpleandpartialcorrelationcoefficientswereonlydetectedwithintheT1BL.1RStralocationgrou,whilesomesignificentrelatiohiwereonlydetectedwithinthenon-T1BL.1RStralocationgrou.AndthesignificantdifferencesofsomesimplecoefficientsweredetectedbetweentheT1BL.1RSand1Bclaes.TheseresultssuggestedthattheT1BL.1RStralocationchromosomenotonlyhadeffectsontheperformanceofagronomiccharactersandgrainproteincontentbutalsohadimpactonthesimpleandpartialcorrelationcoefficientsamongcharacters.

4.UsingAPAGEandSDS-PAGEmethods,thegliadinandHMW-gluteninsubunitsvariatiowereevaluatedinSichuanWhiteWheat,YuanHulledWheat,TibetanWeedraceandXinjiangRiceWheat.In89landracesofSichuanWhiteWheat,atotalof35gliadinpatterand3HMW-gluteninsubunitscombinatiowerefounded.Intheselandraces,2landraceshadidenticalgliadinpartternwith’Chinesering’,and87outof89landraceshadthesameHMW-gluteninsubunitscombinationwith’Chinesering’.In14acceioofYuanHulledWheat,8gliadinpatterand3HMW-gluteninsubunitscombinatiowereaeared.In9acceioofTibetanWeedrace,eachacceionhaduniquegliadinpattern,and4HMW-gluteninsubunitscombinatiowerefoundedintheseacceio.Atotalof9gliadinpatterand5HMW-gluteninsubunitscombinatioweredetectedin9XinjiangRiceWheat.TheseresultsindicatedthatmoregliadinandHMW-gluteninvariatiopresentedinTibatanWeedraceandXinjiangRiceWheatthanSichuanWhiteWheatandYuanHulledWheat.

5.TheallelicvariatioatGli-1,Gli-2andGlu-1lociin89SichuanWhiteWheatlandraces,14YuanHulledWheatacceio,9TibetanWeedraceand9XinjiangRiceWheatacceiowerestudiedbasedontheAPAGEandSDS-PAGEpatter.Therewere14,10,14and11allelesatGli-1inSichuanWhiteWheat,YuanHulledWheat,TibetanWeedraceandXinjiangRiceWheat,reectively.Intotal,15,9,13and12alleleswereidentifiedatGli-2inabovegrou,reectively.Only5,5,6and8alleleswerecharacterizedatGlu-1inabovegrou,reectively.Fromthefrequencyofaparticularalleleateachlocus,itindicatedthatmoreallelicvariatiopresentedinTibatanWeedraceandXinjiangRiceWheatthanSichuanWhiteWheatandYuanHulledWheat.AndtheallelicvariatioatGlu-1werelowerthanGli-1andGli-2.

6.BasedontheallelicvariatioatGli-1,Gli-2andGlu-1loci,thegeneticdiversityateachlociwasinvestigatedinSichuanWhiteWheat,YuanHulledWheat,TibetanWeedraceandXinjiangRiceWheat.TheNei’sgeneticvariationindexes(H)amongabove4grouwere0.3706,0.3798,0.5543and0.5693,reectively.ItindicatedthatthegeneticdiversityofstorageproteingenesamongTibatanWeedraceandXinjiangRiceWheatwerehigherthanthatofSichuanWhiteWheatandYuanHulledWheat.AtGli(Gli-1andGli-2)loci,theNei’sgeneticvariationindexes(H)amongabovegrouwere0.5486,0.6632,0.7161and0.6770,reectively.ButatGlu-1loci,theNei’sgeneticvariationindexes(H)were0.0148,0.1777,0.2305and0.3540,reectively.AndtheNei’sgeneticvariationindexes(H)atGli-B1,Gli-B2andGlu-B1locilocatedonB-genomewerehigherthanthoseofrelativelocionA-and D-genomes.TheseresultssuggestedthatthegeneticdiversityatGliwashigherthanthatofGlu-1,andthegeneticdiversityofstorageproteingenesonB-genomewashigherthanthatofA-andD-genomes.

7.FiveecialPCRprimersforGlu-Ax,Glu-Bx,Glu-A3,Glu-B3andGlu-1Dx5,and2Rprimersforγ-gliadinandLMW-gluteninwereusedtoinvestigatedthestorageproteingenevariatioamong8SichuanWhiteWheatlandraces,14YuanHulledWheatacceio,9TibetanWeedraceand9XinjiangRiceWheatacceio.ThePCRanalysisindicatedthatlowlevelgeneticdiversitywerefoundatGlu-Ax,Glu-Bx,Glu-A3andGlu-B3,whilehighlevelgeneticdiversitywerefoundedattheRlociofγ-gliadinandLMW-glutenin.TheecialDNAfragmentofGlu-1Dx5wasnotdetectedamongall40acceio.Itindicatedthattheredidnothavesubunit5encodedbyGlu-D1intheseacceio.

8.Using28primerset-enzymecombinatioof14STS-PCRmarkersand24Rmarkers,thegeneticvariatioamongSichuanWhiteWheat,YuanHulledWheat,TibetanWeedraceandXinjiangRiceWheatwereinvestigated.Elevenoutof14STS-PCRprimersets(78.6)and16outof28primerset-enzymecombinatio(57.1)werepolymorphic,producingatotalof121fragmentswithanaverageof4.3fragmentsperprimerset-enzymecombinatio.At24Rloci,21Rloci(87.5)werepolymorphic,detectingatotalof83alleleswithanaverageof3.5allelesperRloci.

篇3

分子生物学是从分子水平上研究生命现象、生命本质、生命活动及其规律的科学,是当前生命科学中发展最快并与其他学科交叉渗透最广泛的前沿学科之一.进入21世纪,分子生物学的实验技术与方法已经应用到了生物学各个分支学科的研究中[1].研究生教育是培养具有科学精神和创新能力高层次人才的主要方式,培养硕士研究生创新思维和科学研究能力,将是作为研究生阶段的研究工作和将来作为科研人员所必备的素质.近年来,很多高校在研究生的培养上采取了重大举措,如浙江大学、中国科技大学、西安交通大学、中国农业大学等,实现了研究生的理论教学、实验教学和学位论文研究三阶段的培养模式[2].在加强研究生理论教学和学位论文研究的同时,注重研究生实践能力的培养,增加了实验教学环节,实现研究生实践能力的宽领域培养,再通过学位论文的研究,形成研究生实践能力的立体全方位培养.作为一个生物学研究生,把本科所学的基础知识与科学研究的最新进展联系起来,学好、学通分子生物学是必需的一步.基于此,2012年起我校在生物学科研究生学位课中设置“分子生物学实验”课,3年来虽然取得了明显的成效,得到了研究生与指导教师的认可,但在实际运行过程中也发现了一些问题,还需要通过不断的改革和实践,使生物学科的研究生更系统、更全面地掌握分子生物学的实验技术和技能,为后续的研究性实验工作和今后走上工作岗位提高科研水平打好一个坚实的基础.

1课程定位及理念

分子生物学在20世纪取得了理论和技术的飞速发展.分子生物学技术越来越广泛地应用于生命科学的各个研究领域当中.随着越来越多的理论突破,分子生物学技术也日新月异.在高等院校的生物相关学科的研究生教学中,越来越广泛地注重分子生物学的教学.分子生物学理论课教学内容多,范围广,有一定深度,学生很难透彻理解和掌握,如果不做实验,只学习理论,往往会事倍功半,理不出头绪.分子生物学实验课能给学生亲自动手参与实验全过程的机会,便于学生加深对相关理论的理解[3].研究生来自不同的院校,由于各院校课程设置不同,研究生接受的本科阶段的教育差别很大,这种差别在实验操作能力上体现最为明显.对于已经进入分子时代的生命科学来说,不熟练分子生物学实验操作的学生就很难快速适应课题研究的科研工作.在研究生学位课中设置分子生物学实验课,合理安排实验课内容,建立常规操作与科研课题相结合的实验课程体系,是提升研究生实践能力的重要途径,同时也能为学生完成硕士学位论文及将来从事科研工作打下良好基础.内蒙古科技大学生物学硕士研究生学位点于2006年经批准设立,2007年起招收首批硕士研究生,近10年来,已为及全国输送了一批从事生物学研究与开发的优秀人才.“加强专业技术教学、紧跟学科发展前沿、全面提升研究生培养质量”一直是本学科研究生培养工作的重点和目标.为适应新形势下高等院校研究生教育与创新型人才培养的目标,对研究生分子生物学教学的改革势在必行.2012年以来,我们通过在研究生学位课中设置“分子生物学实验”课,不仅显著地提高了研究生对分子生物学课程的学习热情,而且明显提升了研究生的科研能力.

2课程建设及特色

2．1课程建设的过程与方法

每学年的秋学期初新录取的研究生入学,根据对新生分子生物学知识背景和实验动手能力的详细调研合理安排实验课内容,建立常规操作与科研课题相结合的实验课程体系,并根据学科发展不断更新和完善,力求促进研究生科研工作的顺利开展.研究生分子生物学实验教学的改革分为3个阶段进行.

2．1．1准备阶段

组织相关人员成立课题小组,对小组人员进行具体分工,以2015年新入学的硕士研究生为研究对象,采用问卷调查方式对他们的分子生物学基础知识与实验操作能力进行摸底,撰写调查报告[4].

2．1．2实施阶段

(1)制定教学大纲.根据准备阶段的调查结果讨论研究生分子生物学实验课教学大纲,实验项目实行多层次、模块化管理,分为基础性、综合设计性、创新性3个模块.基础性实验项目以基本的分子生物学操作技术为主,如:质粒DNA的提取、限制性内切酶酶切DNA分子、琼脂糖凝胶电泳分离DN段、大肠杆菌感受态细胞的制备、重组DNA分子的构建与转化等、PCR扩增目的基因等.对没有任何分子生物学常规操作基础的研究生要逐个开出;对本科阶段已经接触并熟悉这些基础性实验的研究生可直接开出综合设计性实验,如:多种方法获得目的基因、动植物中某关键基因的克隆、重组质粒的构建等.创新性实验项目全部由本学科教师承担的科研课题转化而来,研究生可根据自己的研究方向与兴趣爱好选择项目完成,包括植物细胞中MYB类转录因子的筛选、与人类遗传病相关的核苷酸重复序列的克隆等.

(2)学生选课.将全部实验教学内容及具体开出安排提前公布,学生根据实际情况与自己的研究方向进行实验内容的选择,这一环节须由指导教师协助完成.选课结束后根据每个项目的选课情况准备实验,包括学生分组、准备实验材料、仪器设备、耗材试剂和实验讲义与实验报告册分发等.

(3)预实验.指导教师根据学生分组情况,每组安排组长一名,副组长一名,在实验开出前协助指导教师完成预实验.

(4)实验课开出.按计划认真组织研究生开出实验.实验操作阶段,要求学生熟练掌握实验操作流程,严格按规范进行操作.同时指导教师要充分调动学生的学习积极性和主动性,增强学生独立完成实验的能力和实际动手能力,使学生能够尽可能主动地、独立地完成实验的整个过程,为以后独立从事科研设计和科学实验打下良好的基础.

(5)课程考核.实验课结束后进行成绩考核,综合学生的预习报告、实验操作、实验结果与实验报告撰写情况给出实验课成绩.

(6)编写研究生实验教材.基于教学实践的积累,编写研究生实验教材“研究生现代分子生物学实验”,重点面向研究生的实验教学,将分子生物学基本实验技术和近年来发展起来的新技术、新方法有机融合.

2．1．3总结阶段

跟踪调查,了解研究生在分子生物学实验课结束进入课题研究后的情况,掌握他们在分子操作各个环节上的操作熟练程度,对取得的研究资料做全面的整理分析.在学科内部推出“研究生分子生物学实验”示范课,并完成相应的资料库与光盘制作,并进一步在全校范围内推广.同时课程改革小组的成员要不断讨论项目实施过程中存在的问题,并及时与兄弟院校沟通学习,提出切实可行的办法[5].

2．2指导教师队伍建设

自2012年生物学科硕士研究生开设分子生物学实验课以来,该课程的教学任务一直由我校外聘的留美分子生物学专家王建英教授负责,另配2名讲师作为助手.经过3年来的教学实践体会,加上学生与研究生导师的意见反馈,我们发现这种单一的指导教师模式是需要改进的,需要建设一支由长期工作在科研、教学一线教师组成的研究生实验课教学团队.教学任务分配上,根据团队内每位教师主要从事的科研领域和专业特长,分配相应的实验教学内容,每个项目安排2名指导教师,他们不仅熟悉所指导实验的技术要点,及时解决实验过程中出现的各种问题,还能将本领域相关的科研前沿、热点问题介绍给学生,以开阔学生视野,使每次实验均能获得预期结果.同时,指导教师在教学实践过程中也不断发现和审视自己,包括对自身专业知识的把握与实验技能熟练程度的反思,这样也能促使他们紧密跟踪学科发展前沿不断提高[6].本课程经各方面协调讨论,现已逐渐组建了一支人员稳定、业务基础全面、具有团结协作精神的教学团队.其中教授3人、副教授2人、讲师2人.其中大多数教师承担国家自然科学基金、内蒙古自然科学基金、内蒙古高校基金等科研项目,在努力完成这些科研任务的同时,有意识地将许多科研工作中的思路和先进的技术转化到研究生分子生物学实验的教学实践中.实验课教学团队的建设极大地提高了研究生实验教学质量,并申请得到了我校研究生教学改革项目建设立项资助.

2．3实验课成绩考核与结果评价

经过教学团队的调研讨论,针对分子生物学实验考核形式的问题,提出实验课评价体系多层次评价的管理制度,包含预习报告、平时考勤、实验操作、实验结果与实验报告撰写情况5个部分,分别所占比例为1∶2∶4∶1∶2;针对设计性与创新性实验,要加上实验方案制定与实验论文撰写环节.针对研究生各实验组人数较少、时间较灵活、学生专业多样化等特点,在考核中更加注重实验的具体操作过程.在课程开课初要将考核方案告知学生,让他们明确各环节的评分标准,在实际考核过程中如实记录作为评价依据.实验课结束后,通过“问卷调查与后期跟踪相结合”的模式及时对教学效果进行评价[7].通过发放问卷调查表的方式综合调查研究生对本门实验课的内容设置、教学方法及授课教师的教学效果等信息的评价.另外,在实验课结束一个学期后,我们对研究生指导教师进行问卷调查,对上一年度的实验教学效果进行了后期跟踪评价,对研究生进入到各自实验室工作后的科研思维、实验设计、操作能力等进行调研,综合评价实验教学效果[8].

3结语

分子生物学实验技术是生物学各分支学科科学研究必备的手段,在研究生入学后进入课题研究之前开设“分子生物学实验”课,熟练掌握基本的分子生物学操作技术,这是生物学研究生快速进入科研课题与顺利完成硕士学业的基本保证[9].研究生经过基本实验技能培训、全面综合实验及自主设计实验的锻炼及创新实验平台的全方位提升,科研能力得到大幅度提高.学生普遍反映研究生分子生物学实验为他们顺利进行课题研究、完成学位论文和未来的科研工作奠定了良好基础,一部分学生在硕士期间就发表了高水平的SCI论文.为生物学研究生开设分子生物学综合实验,在内蒙区内外兄弟院校进行此类设置的尚不多见,需要我们更加努力创立并逐步完善研究生实验教学平台,全面提升我校硕士研究生培养水平[10G12],及时将教师的科研成果提炼引入实验教学,提高指导教师的教学能力,使实验内容不断更新,为研究生进行课题研究及毕业以后从事相关的科研工作打下坚实的基础.

参考文献(References)

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[4]郭淑贞,李丽娜,张前,等．基于问卷调查的中医院校研究生分子生物学实验课程改革探索[J]．内蒙古中医药,2014(12):138G139．

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[6]郑源强,包玉龙,丁枫．研究生医学免疫学实验教学改革与探索[J]．中国免疫学杂志,2015,31(4):548G550．

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篇4

中图分类号 G642.0 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2014）21-0332-02

分子生物学是目前农林院校生物专业及涉农专业的主干课程，是从分子水平研究生命本质的一门新兴学科。它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为主要研究内容，在当前生命科学中发展较快，并正在与其他学科广泛交叉与渗透。分子生物学的发展为人类认识生命现象带来了前所未有的机会，也为人类利用和改造生物创造了极为广阔的前景。学好分子生物学，学会运用基本的实验技术对遗传物质进行实验操作，对于培养和训练学生的研究性思维很有帮助[1-2]。目前，各个院校生物专业均开设了分子生物学与分子生物学实验课，分子生物学实验课程是一门年轻的课程，从20世纪90年代初期开始，随着分子生物学日新月异的发展，分子生物学实验技术已逐渐成为生命科学各学科重要的研究工具。但是目前分子生物学实验课存在着知识更新慢，实验内容单一[3]，实验内容更新速度慢等问题，难以满足分子生物学发展的需要。本文针对目前分子生物学实验课现状，结合笔者自身体会，提出综合性实验的内容和可行性，进行实验课的改革和创新。安徽农业大学生命科学学院实验教学中心把科学研究中较成熟的科研项目逐步运用于实验教学中，通过开展综合性、设计性实验的探索，取得了理想的效果。

1 农业院校分子生物学实验课程现状

目前各个高校均开设了分子生物学实验课，从20学时至60学时都有。但是目前各个高校的分子生物学实验内容大同小异，验证性实验多，知识点少，综合性不强。主要内容一般包括基因组DNA提取、琼脂糖凝胶电泳、PCR反应、质粒DNA提取、感受态细胞制备、DNA的分子杂交等[4-5]，目前分子生物学实验课的开设基本采用集中教学的方法，因为分子生物学实验一般需要的时间较长，一个实验项目短则连续1 d完成，长则连续3 d完成。但是在目前分子生物学的实验课程安排上每个项目基本是单独存在的，而且基本是一些验证性的实验。但目前分子生物学技术往往实际使用的是连贯的技术体系，目前的分子生物学实验课只能训练学生的基本技能，无法进行综合能力的培养[6]。学生学习了实验课内容后，记忆不强，印象不深，且在毕业论文及以后学习中，难以综合应用分子生物学实验技术。但在实际应用中分子生物学需要与其他学科相交叉，才能更好地发挥作用。基于分子生物学实验课程现状分析，提出了合理确定课程内容，培养学生创新能力，训练扎实的基本功，利用现代化教学手段使实验内容更加生动形象、丰富多彩，并严格要求，以科研促进实验教学改革，自主设计综合性实验以及实行开放式教学等若干合理对策。

2 综合性实验实施案例

综合性实验重点体现“综合”二字，本综合性实验名称为《水稻愈伤组织诱导及转GUS基因鉴定》，涉及的实验技术比较多，而且每个环节都有联系，最终达到一个实验目的，解决一个问题。本实验以水稻种子为材料，从愈伤组织诱导、农杆菌的培养、GUS基因载体的转化、GUS基因的染色等方面，学习农杆菌导入方法，熟悉水稻转基因的全部流程，掌握GUS基因作为标记基因的优点，从而掌握植物转基因的各个环节，为以后的功能基因组学研究打下基础。实验目的为使学生明确实验流程（图1），熟悉科研课题的设计，并且训练学生的科研素养。实验内容主要包括：①水稻胚性愈伤组织诱导；②农杆菌感受态细胞的制备；③液氮冻融法把重组子导入农杆菌；④农杆菌与水稻愈伤组织的共培养和筛选；⑤水稻转基因抗性植株的获得和鉴定；⑥水稻愈伤组织和叶片的GUS染色[7-8]。然后根据实验内容撰写论文，论文的格式同格式，要求图文并茂。

水稻愈伤组织诱导实验需要学生结合前期组织培养技术的学习，回顾学过的实验技术。农杆菌感受态细胞的制备也是分子生物学实验中的内容，同时结合了微生物培养的实验技术[9]。液氮冻融法把重组子导入农杆菌是植物转基因中常用的实验技术，与上一个内容相连接，同时对阳性菌株的检验又会使用质粒提取、PCR等技术。农杆菌与水稻愈伤组织的共培养和筛选综合运用了植物转基因的知识，使学生认识到植物转基因的步骤和原理[10]。水稻转基因抗性植株的获得和鉴定又结合了植物基因组提取、PCR等分子生物学实验技术。水稻愈伤组织和叶片的GUS染色实验使学生熟悉了标记基因在转基因中的应用，基本实验过程见图2。总之在本综合性实验技术中，不仅包含了普通分子生物学实验中大部分实验技术，且与其他学科实验技术融会贯通，更重要的是整个实验室成为一个有机的整体，有一个明确的实验目的。学生在实验中不仅要观察实验现象，进行拍照，同时要进行数据统计，优化实验参数。

3 综合性实验实施效果分析

3.1 实验时间灵活，周期长

根据分子生物学实验的特点和各校教学时间设计情况，在时间上对分子生物学实验进行灵活而又合理的安排。该综合实验持续2～3个月的时间，学生可利用空余时间进行实验，而不一定要在固定时间进行，且实验周期长，学生能学会更多知识内容。

3.2 实验内容丰富，综合性知识多

该实验不仅涉及到分子生物学的实验技术，细胞学、微生物学等实验技术也有涉及，起到了综合运用多种实验技术的目的，同时也是对原来实验技术的复习和回顾。比如本实验中使用了组织培养技术，属于细胞工程实验的内容，农杆菌培养属于微生物学实验内容，再结合分子生物学实验内容，体现了该实验的综合性。

3.3 考核方式灵活，重过程，轻结果

以往的分子生物学实验报告，每位同学的报告内容基本相同，抄袭现象严重，因为每位同学的实验步骤、方法，甚至结果都基本相同。综合性实验要求按照科研论文的形式上交，每位同学都要收集图片、统计数据，因此每个人的实验图表各不相同，通过图和表以及文字的叙述来衡量学生的技能掌握情况，比用单纯的实验报告效果更好。

3.4 培养了学生的动手能力，教师起到辅导作用

以往的实验课中教师授课时间基本占1/3，学生按照固定的模式去做实验，基本都是一些重复性的结果，学生往往是机械性地操作，实验内容枯燥乏味。综合性实验教师起到的是导师作用，进行实验的指导，学生往往需要自己查阅文献、配制试剂，并把实验作为一个课题来研究，提高了学生的思考意识和能力。此外，安排研究生进行助教工作，将综合性实验与研究生实验进行有效结合[11]。同时也减少了实验教师的工作量，从传统机械性的教学模式转变为实验性的辅导。

4 结语

农业院校生物学专业必须结合实际要求，植物转基因和基因工程是生物专业必须要了解的知识。但是目前分子生物学实验教学中，往往进行的都是分子生物学基本技能的培养，缺乏深层次和系统性的实验，学生学习兴趣不大。本文从多方面阐述了综合性实验在分子生物学实验教学中的必要性，同时以《水稻愈伤组织诱导及转GUS基因鉴定》综合性实验为例，列举了该实验集合了多项实验技能，能够通过这样的实验项目锻炼学生的实验技能，同时进行了科研能力的训练，在今后农业院校分子生物学实验教学中应该多采用综合性实验教学的模式。

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（上接第333页）

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