干细胞培养技术范文
时间：2023-06-20 17:43:57
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篇1
近年来，人类组织干细胞的研究已成为国内外学者关注的焦点，表皮干细胞即是其中之一。表皮干细胞是一种在成年期还能维持较高的自我更新能力的细胞群，在正常状态下维持表皮的自我更新，当受到损伤刺激时，表皮干细胞可以参与皮肤损伤的修复[1]。随着人口老龄化速度加快，慢性溃疡及皮肤病患者日益增多，加之烧伤及意外创伤造成的皮肤缺损，临床对皮肤移植的需求越来越大。由于表皮干细胞数量少，缺乏明确的特异性分子标志，体外培养很容易丢失其干细胞生物学特性，增加了分离培养的难度。获得大量高纯度的表皮干细胞成为该领域研究的关键技术。我们根据几年来在细胞培养方面的工作实践，将人表皮干细胞的培养技术总结如下。
1 人表皮干细胞的分离与培养
应用IV型胶原快速粘附法从手术切除的人包皮组织中分离表皮细胞中的快速粘附细胞，这一群细胞被认为是表皮干细胞，它具有快速粘附、缓慢生长的特点[2]。取年龄在5～25岁无泌尿系统感染患者的包皮皮片，无菌条件下去除皮下脂肪层，用含青霉素、链霉素的PBS反复冲洗皮片数次，修剪成大小约0.5 cm×0.5 cm的皮片，置于培养皿中，加入0.25%中性蛋白酶10 ml，4℃消化l4～16 h，吸弃上清，分离表皮和真皮层。剪碎表皮，用0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化，37℃，10 min，加入含有10%胎牛血清的DMEM终止消化，反复吹吸至细胞悬浮，200目筛网研磨过滤。滤液经1 000转/min离心10 min，弃上清，收集细胞。加入表皮干细胞培养基(每100 ml KSFM培养基加入0.05 mmol氯化钙100 μl、HKGS添加剂1 ml)并轻柔吹打制成单细胞悬液，接种于预先铺有Ⅳ型胶原的培养瓶中，37℃孵育15 min。倒置镜下观察，粘附在Ⅳ型胶原被膜上的细胞为表皮干细胞，吸出细胞悬液，用DHank’s液洗2次，加入表皮干细胞培养基，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。2 d换液1次，显微镜下观察细胞生长，2～3 d内细胞开始分裂，4～5 d后会出现许多细胞克隆或集落。培养基中钙离子的浓度是保持人表皮干细胞既增殖又不分化的关键。钙离子浓度过低，会导致所培养的人表皮干细胞生长缓慢或不生长;若钙离子浓度过高，则加速了细胞分化。我们在实验中筛选出适合的培养基中钙离子浓度，可以保证有效的培养维持。在培养过程中，还要经常检查培养箱温度和CO2的浓度，过低或过高的温度和CO2含量都影响人表皮干细胞的生长，容易出现细胞老化和衰退现象。为了避免各种细菌、真菌污染培养箱，每周用75%的酒精擦洗箱内的托盘、格架、箱壁。托盘始终装有一定量的饱和浓度磷酸氢二钠(Na2HPO4)液体，细菌既不能在其中生长，也能提供合适的湿度[3]。
2 人表皮干细胞的传代
当原代细胞达到70%～80%融合时，需进行传代，否则细胞会没有足够的生长空间，也会因为营养耗竭而影响生长[4]。用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化培养瓶内细胞，置37℃温育5 min，必须经常在显微镜下观察细胞被消化的情况，若细胞部分漂浮起来，即可终止消化。加入2 ml终止液，用吸管反复轻轻吹打贴壁细胞，使其形成细胞悬液，按1∶2传代。传代细胞接种于IV型胶原预铺的培养瓶中。
3 人表皮干细胞的冻存
细胞不用或保种时，可将细胞冷冻保存在液氮中。细胞在培养基中直接降温冷冻，可因细胞内、外环境中的水而形成冰晶，导致细胞内发生一系列变化，如机械损伤、渗透压改变、蛋白变性等，从而引起细胞死亡。因此，细胞培养基中要加入保护剂二甲基亚砜(DMSO)或甘油。为保持细胞最大存活率，冻存时要遵循“慢冻快融”的原则。一般用第2代人表皮干细胞培养至对数生长期时，用含胎牛血清的DMEM培养液将细胞配成5×106 /ml 的细胞悬液，1 000转/min，离心10 min，弃去上清，加入1～2 ml 含有10%DMSO的冻存液，用吸管小心吹打，重新悬浮细胞，分装于2 ml冻存管中，将盖拧紧，用记号笔记好细胞名称、细胞代数、冻存日期、操作人等。放入-70℃冰箱过夜后，再转入液氮罐中保存。注意：用于冻存的细胞应在光镜下观察生长状态良好，冻存细胞的体积不要超过冻存管体积的1/2。
4 人表皮干细胞的复苏
从液氮中取出冻存管后，迅速投入预先准备的40～42℃水中，并不时摇动，让细胞冻存液快速解冻1 min左右。取出冻存管，用75%酒精擦拭消毒外壁后，吸出细胞悬液，加至10 ml离心管中，补加含胎牛血清的DMEM培养液，小心吹打使细胞分散悬浮。1 000转/min，低速离心10 min，弃去上清，加入表皮干细胞用的条件培养基适当稀释后，转入IV型胶原预铺的培养瓶中，置37℃，5%CO2饱和水蒸汽培养箱中培养。复苏后要每天观察细胞状态，待细胞生长至适当密度时，及时分瓶培养或实验待用。
人表皮干细胞培养技术发展迅速，但诸如细胞在体外培养容易变形，多次传代后细胞克隆形成率明显下降，细胞逐渐分化难以保持原代细胞特性等问题，还有待更好地解决。
参考文献
1 Michel M，Torok N，Godbout MJ，et al.Keratin 19 as a biochemical marker of skin stem cells in vivo and in vitro: keratin 19 expressing cells are differentially localized in function of anatomic sites，and their number varies with donor age and culture stage.J Cell Sci，1996，109 (Pt 5): 10171028.
篇2
目的： 建立胎鼠大脑皮层神经干细胞体外分离、培养、分化及鉴定的方法，探讨神经干细胞的基本生物学特性。方法： 取孕14 d胎鼠大脑皮层，吸管吹打机械分离制成单细胞悬液，采用无血清培养和胎牛血清诱导分化， 应用免疫荧光技术鉴定神经干细胞及其分化的子代细胞。结果： 从胎鼠大脑皮层分离的细胞呈神经巢蛋白（Nestin）免疫阳性并能在体外传代培养，血清诱导分化后的细胞可表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白，诱导分化成的神经元能表达突触的特异性标志Synatophymin。结论： 分离和培养的细胞能表达神经干细胞的特异性标志物Nestin，并且具有很强的增殖能力和多向分化潜能，属于中枢神经系统的神经干细胞。
【关键词】 干细胞 大脑皮质 细胞培养 细胞分化 胚胎 大鼠 Sprague Dawley
［Abstract］ Objective: To establish a method for isolation， cultivation， differentiation induction， and identification of neural stem cells (NSCs) from embryonic rat in vitro， and explore the basic biological features of these cells. Methods： The mesencephalon of rat with conceptus age of 13 days was taken out and dissociated into single cell suspension mechanically， and then cultured in serumfree medium. Fetal bovine serum was used to induce cell differentiation. The isolated cells and their progeny were observed by using immunofluorescence technique. Result： The isolated cells showed nestin positive reaction and could be cultured in vitro in series. After being induced by fetal bovine serum， microtubuleassociated protein 2 (MAP2) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) which are specific antigens in neuron and astrocyte expressed in these cells， and synatophymin， a specific signal of synapse， was also expressed in the differentiated neurons. Conclusion： The isolated and cultured cells are NSCs of central nervous system， and possess strong capability of proliferation and potency of multidirectional differentiation.
［Key words］ stem cells; cerebral cortex; cell culture; cell differentiation; embryo; rats， spraguedawley
传统观念认为，哺乳动物的神经组织只有死亡，没有再生能力。自从上世纪90年代初科学家们分离、培养出神经干细胞(Neural stem cells，NSCs）以来，人们相继从各种动物及人的中枢神经系统分离、培养了NSCs[1，2] 。NSCs的发现不仅打破了神经元不会再生的传统观念，而且为许多以往难以治疗的神经系统疾病提供了新的治疗思路和途径。2007年6月利用细胞分离、无血清培养、血清诱导分化及免疫荧光等技术，证明了本实验所分离的细胞群为NSCs，以期为进一步使用和研究NSCs奠定理论及实验基础。
1 材料与方法
1.1 材料
DMEM/F12、B27、胎牛血清购自GIBCO公司，bFGF、Nestin抗体、突触素抗体Snaptophysin购自SIGMA公司，MAP2抗体、GFAP抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司，倒置相差显微镜及荧光显微镜为NIKON公司产品。
1.2 NSCs的分离培养[3～5]
成年雌性和雄性SD大鼠各1只，体重220～260 g，雌雄合笼后，检查阴栓，见阴栓计为孕0 d；孕14 d时取胎鼠，在解剖显微镜下仔细分离获得胎鼠大脑皮层，再用DHanks液漂洗，用眼科剪反复切割组织，再用200目细胞筛过滤，收集入离心管中，反复吹打，制成单细胞悬液，经细胞计数后，分装入50 ml培养瓶中，细胞数约为1×106/ml。培养条件: DMEM/F12 6 ml+B27120 μl + bFGF12 μ1，37 ℃， 5%CO2; 每6～7 d传代1次。
1.3 NSCs的诱导分化
取第4代传代培养的NSCs，将其吹打成单细胞后，以5×104/片细胞密度种于经0.1%多聚赖氨酸处理过的盖玻片上，培养条件为: DMEM/F121.5 ml + B2730 μl + FBS 150 μl， 37 ℃，5%CO2，培养7 d。
1.4 免疫荧光单标法鉴定NSCs及其子代细胞
1.4.1 Nestin免疫反应阳性细胞
将悬浮培养的细胞团用4 %多聚甲醛固定30 min后涂在载玻片上，37 ℃烘干，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，加入一抗Nestin（1∶100）后4 ℃过夜，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，加入二抗兔抗羊TRITC(1∶100)后37 ℃孵育1 h，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，荧光显微镜下观察。
1.4.2 MAP2 、GFAP、Snaptophymin免疫反应阳性细胞
取诱导分化的NSCs的细胞盖玻片用4%多聚甲醛固定30 min，37 ℃烘干，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，分别加入一抗MAP2（1∶100）、GFAP（1∶100）和Snaptophysin（1∶100）后4 ℃过夜，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，分别加入二抗羊抗兔FITC(1∶100)和羊抗兔Cy3(1∶100)后37 ℃孵育1 h，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，荧光显微镜下观察。
2 结果
2.1 NSCs的形态学特征及鉴定
由孕14 d胎鼠大脑皮层分离培养的原代细胞， 接种后立即在相差显微镜下观察，细胞呈悬浮的圆形状，边界清楚，折光性强，绝大部分单个存在。经6～7 d无血清加bFGF培养后，细胞呈球状集落， 95 %以上的NSCs球呈悬浮生长，细胞增殖旺盛（图1）。原代培养时，培养瓶中可见一些细胞碎片和一些贴壁的杂细胞，但经传代后，这些杂质均减少甚至消失，且生长状态良好。在相差显微镜下，NSCs呈球形或椭圆形，大小不一。经Nestin免疫荧光染色鉴定显示神经干细胞球呈红色荧光（图2）。
2.2 NSCs的诱导分化及其鉴定
胎鼠大脑皮层神经干细胞的分离培养、分化及鉴定在NSCs培养液中加入10%胎牛血清3 h后，NSCs球即开始贴壁和分化，6 h后即可明显发现有突起从团块边缘长出，24 h后有少数细胞分化为有突起的细胞，以后分化的细胞逐渐增多，从细胞球周围迁移出，呈放射状排列（图3）；随着时间的推移，突起不断增粗与延长并互相连接成网状，7 d时在相差显微镜下NSCs球周围可见分化成胞体圆形丰满的神经元样细胞和突起粗大的胶质细胞样细胞。免疫荧光染色显示，在胎牛血清的诱导分化下NSCs能分化成表达各种相应特异性标志的终末细胞，即表达MAP2的神经元（图4）、表达GFAP的星形胶质细胞（图5）；同时，从NSCs分化而来的神经元能表达突触素（图6）。
3 讨论
NSCs是指在哺乳动物中枢神经系统内具有多向分化潜能和自我复制能力的一群细胞，由于具有广阔的应用前景而受到神经科学领域众多研究者的关注，在治疗恶性胶质瘤、神经系统损伤、中枢神经系统慢性退行性疾病（帕金森病、亨廷顿病）等方面已取得丰硕的成果[6～8]。
NSCs在哺乳动物中枢神经系统内分布非常广泛，本实验从大脑皮层取材，采用机械分离法来制备NSCs悬液，实验效果比较理想。NSCs悬液的制备有酶消化法和机械分离法，但以酶消化法使用居多。由于在实际操作中很难从客观上准确地把握酶作用的最佳时间点，往往导致消化不足而不易获得单细胞悬液；或消化过度造成细胞受损而导致细胞活力下降甚至死亡。并且，在NSCs表面具有针对许多神经生长因子的受体[9]，当采用酶消化法来获取NSCs时， 可能会引起细胞表面受损而致使一部分受体丢失，而这些受体对于NSCs 维持其干细胞的未分化状态是必需的。所以采用显微解剖和吸管吹打等机械分离方法来制备NSCs悬液是神经干细胞分离中较为理想的方法。
本实验发现在原代培养时，培养瓶中可见大量的细胞碎片和一些贴壁的细胞，但经传代3～5代后，这些杂质逐渐减少甚至消失。这主要是由于培养液中所含的bFGF只对NSCs具有促进分裂和增殖作用[10，11]，而其他杂细胞在该培养液中无法生长。因此，原代细胞中大部分非NSCs会发生死亡，而NSCs不仅可以存活，还可以分裂和增殖，形成神经干细胞球，从而经过多次传代后， NSCs可以得到纯化。
Nestin是神经干细胞的一个标志物，本实验培养的细胞通过免疫荧光观察培养的细胞球均呈Nestin免疫反应阳性，提示组成细胞球的细胞为NSCs。当在培养液中加入10％的胎牛血清后，NSCs可以分化为神经元样细胞和胶质细胞样细胞。免疫荧光显示，诱导分化7 d后NSCs可以分化为表达MAP2的神经元和表达GFAP的星形胶质细胞，证明了NSCs具有多向分化潜能。同时，本研究观察到从NSCs诱导分化成的神经元突起上有分化较好的串珠样排列的膨体，突触素免疫荧光染色阳性，显示其已经具备接受信息的结构基础，表明分化的神经元能够合成和运输神经递质，行使可能的生理功能[12]。
实验从孕14 d胎鼠大脑皮层分离培养的细胞团具备NSCs的三大特征：Nestin免疫反应阳性、分裂增殖能力和多向分化潜能，由此证明了所分离培养的细胞是NSCs。并且，由血清诱导分化而来的神经元具备一定的生理功能，可以用于进一步的实验研究。
参考文献
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[4]曹中伟，马虹，曾倩，等.大鼠胚胎脑组织神经干细胞培养和鉴定[J]。解剖学进展，2006（1）：29-31.
[5]季丽莉，佟雷，王振宇.神经干细胞的生物学特性和体外培养鉴定[J]. 解剖学进展，2007(2)：180-183.
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[8]Eslamboli A，Georgievska B，Ridvey RM，et al.Continuous lowlevel gliney cell linederivedneurotrophic factor delivery using recombine adenoassociated viral rectors provides neuron protection and induces behavioral recovery in primate model of Parkionsons disease [J].J Neurosci，2005(4):769-777.
[9]Kallos MS， Behie LA， Vescovi AL. Extended serial passaging of mammalian neural stem cells in suspension bioreactors[J]. Biotech Bioeng， 1999(5): 589-599.
篇3
1. 1 材料
1. 1. 1 主要仪器:CO2培养箱、净化工作台、倒置显微镜、倒置荧光显微镜、共聚焦荧光显微镜、流式细胞仪。
1. 1. 2 主要试剂:DMEM 高糖培养基( Dulbeccosmodified Eagles medium，DMEM)、人表皮生长因子(EGF)、0.25%含 EDTA 的胰蛋白酶(0. 25% trysin-EDTA)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、抗生素(penicillin，streptomycin)、PBS 缓冲液购自于 Gibco公司。Oct-4、Sox-2、SSEA-4、nestin、vimentin、BDNF、NGF、CD90 购自与 Abcam 公司。CD29、CD44 购自于 eBioscience 公司、CD45、CD11b 购自于 BD 公司。
1. 1. 3 实验动物:SPF 级孕 18 ～ 18. 5 d 的 SD 大鼠，购自中国军科院实验动物中心，许可证号:[SCXK-(军)2014-0004]，实验动物使用批准号:ILAS-PL-2014-001。在无菌条件下进行实验操作分离羊膜组织。
1. 2 方法
1. 2. 1 羊膜细胞分离及培养:SD 孕鼠腹腔注射 1% 戊巴比妥钠(0. 01 mL /g)，麻醉后，无菌条件下开腹，机械性分离子宫层，剥离胎盘，分离羊膜组织置于含有500 U/mL 双抗的 PBS 溶液中冲洗。将羊膜组织放置在含有500 U/mL 双抗的 DMEM 基础培养基中，无菌眼科剪将其剪至1 mm3左右的小块。将组织悬液移至50 mL 离心管中，1 000 r/min 离心 5min，弃上清液。加入 0. 25% 含 EDTA 的胰蛋白酶10 mL，37℃ ，5% CO2条件下消化 20 ～30 min。用含有10%胎牛血清的完全培养基终止消化。200 目不锈钢滤网过滤单细胞悬液，接种至 25 cm2培养瓶，含10% FBS、10 g/LEGF 和 500 U/mL 双抗的DMEM 完全培养基培养，隔天细胞换液，2 ～ 3 d 后细胞长满培养瓶85% ～90%时，进行细胞传代。
1. 2. 2 流式细胞术检测:取培养 2 ～ 4 代细胞，用0. 25% 含 EDTA 的胰蛋白酶消化，含 10% FBS 的DMEM 完全培养基终止消化。细胞计数将其稀释成1 106个，每个流式管1 mL 细胞悬液。每流式管加2 mL PBS 使细胞混匀，2 000 r/min 离心5 min，弃上清液。重复加2 mL PBS 重悬细胞，2 000 r/min离心5 min，弃上清液。每管加 50 L PBS 重悬细胞，加 抗 体 CD29-PE-Cy7、CD44-PE、CD90-FITC、CD45-PE-CY7、CD11b-APC，避光室温孵育 30 min。每管加2 mL PBS 重悬细胞2000 r/min 离心5 min，弃上清液。各管加300 L PBS 重悬细胞上机检测。
1. 2. 3 免疫荧光细胞染色:取 2 ～ 4 代细胞，0. 25%含 EDTA 胰蛋白酶消化，含 10% FBS 的 DMEM 完全培养基终止消化。加入完全培养基重悬，至24 孔板中培养。待细胞增殖至 70% 作用时，PBS 冲洗，4% 多聚甲醛(预冷)固定 10 min。PBS 冲洗 2 次，每次5 mim。1% Tuiton-100 孵育10 min。PBS 冲洗2 次，每次 5 mim。山羊血清工作液每孔 100 L 室温下封闭30 min。吸去山羊血清工作液，抗体稀释液稀释抗体 Oct-4(1∶ 200)、Sox-2(1∶ 200)、SSEA-4(1∶200)、nestin(1∶100)、vimentin(1∶100)，每孔100L，4℃过夜孵育。PBS 冲洗 3 次，每次 5 min。避光条件下，PBS 稀释 FITC 标记的羊抗鼠二抗(1∶200)，37℃避光孵育 30 min。PBS 冲洗 3 次，每次5 min。DAPI 封片剂封片。共聚焦荧光显微镜观察。
1. 3 统计学方法实验结果采用 x珋 s 表示，使用 SPSS 15.0 统计软件进行统计处理，对其进行单因素方差分析和LSD 检验，P 0. 05 表示差异具有统计学意义。
2 结果
2. 1 分离细胞培养分离培养大鼠羊膜细胞，镜下，细胞呈变形虫样生长(图 1a)，生长速度快(图 1b)，需隔天换液传代。本实验中大鼠羊膜细胞可传至6 ～7 代。
2. 2 流式细胞术鉴定细胞表面抗原结果经流式细胞术鉴定大鼠羊膜细胞间充质细胞表面标记物 CD29、CD44 分别为97. 6%和95. 8%。细胞表面抗原CD90、CD45 几乎不表达，CD11b 有少量表达(图2 见文后彩插6)。
2. 3 细胞免疫荧光鉴定细胞表面标记物结果本实验通过细胞免疫荧光方法检测大鼠羊膜细胞表达干细胞标记物 Oct-4 和 Sox-2(如图 3)，神经干细胞标记物 nestin 和间充质干细胞标记物vimentin(如图 4)，( 图 3 ～ 4 见文后彩插 7) 并表达胚胎干细胞标记物 SSEA-4(如图 5)。可表达神经营养因子 BDNF 和NGF(如图6)(图5 ～6 见文后彩插8)。
3 讨论
篇4
【关键词】 组织块培养法;视网膜干细胞;分离;培养;鉴定
METHODS: The tissue of ciliary body of postnatal 10 days rat was isolated and pided into small bits， then cultivated with nonserum DMEM/F12 medium， 20μg/L bFGF， 20μg/L EGF and 1×B27 supplement at the same time， the embryonic brain derived neural stem cells (NSC) were isolated and cultivated with routine method as positive control. These two kinds of cells were identified by detection of nestin with immunofluorescence method， which was known as a marker of neural stem cells. The characteristic of differentiation of RSC was identified in the induced condition of 100mL/L FBS medium.
RESULTS: In the primary cultivation， cell spheres with high refraction were observed 48 hours after isolation and cultivation. The cell spheres enlarged and the amount increased gradually in the fourth or fifth day of cultivation. The passage of the cells occurred in the seventh day of cultivation， and the cells of the next passage can also formed the sphere shape. The marker nestin was detected both in RSC and NSC by immunofluorescence method. The RSC became adherent with the bottom of the culture dish in the induced condition with serum， and some of the cells differentiated into cells with neural cell shapes. The characteristics of the shape， proliferation and differentiation of RSC were similar with NSC.
CONCLUSION: Tissue cultivation has the characteristics of less damage and convenience， which can be used in the isolation and cultivation of RSC successfully.
视网膜干细胞(retinal stem cell， RSC)是近年来发现的成体干细胞之一。RSC在体外培养中可自我更新和增殖，亦具有多向分化的潜能，可在一定条件下诱导分化成为神经元细胞及神经胶质细胞。RSC在体外培养、分化与移植方面的研究进展为我们最终应用这些研究成果来有效的治疗致盲性眼病带来了希望，因而，成功对其进行分离，体外培养及鉴定则为进一步研究其分化机制及细胞治疗、基因治疗奠定基础。图1原代干细胞(IM×100) A:视网膜干细胞;B:神经干细胞。图2Nestin免疫荧光染色阳性(IF×100) A:第2代视网膜干细胞;B:第2代神经干细胞。
1材料和方法
1.1材料
孕18d Wistar大鼠及出生10d鼠，由吉林大学动物中心提供。DMEM/F12培养基、胎牛血清(Gibco公司)，B27添加剂(Invitrogen公司)，胰蛋白酶、EDTA(Sigma公司)，神经巢蛋白(nestin)兔抗大鼠多克隆抗体，FITC羊抗兔抗体(武汉博士德公司)， CO2培养箱(日本SANYO公司)，倒置相差显微镜( Olympus)，超净工作台(苏州净化设备厂)等。
1.2方法
将出生10d的Wistar鼠断颈处死后置于750mL/L乙醇中消毒5min，取出眼球，浸泡于DMEM/F12培养液的培养皿中。更换新的无菌器械，在解剖显微镜下，首先剔除眼球外组织及视神经，在角巩膜缘后3～4mm处环形剪开眼球，仔细去除晶状体、玻璃体及视网膜。取出睫状体组织放入另一无菌皿内，应用微观剪刀尽量将组织剪成碎块，加入DMEM/F12培养液吹打均匀，移入24孔板中培养，并于孔板中加入20μg/L大鼠表皮生长因子(EGF)，20μg/L大鼠碱性成纤维生长因子(bFGF)及1×B27添加剂，于37℃，50mL/L CO2、饱和湿度条件下培养。每天以倒置显微镜观察细胞形态变化和生长状况。当细胞形成较大团体时予以传代，首先离心收集细胞，用2.5g/L含有EDTA的胰蛋白酶500μL消化细胞约2min，以含100mL/L胎牛血清的培养液中止消化，用移液枪吹打使细胞分散，离心去上清后，应用DMEM/F12培养液洗涤1遍，按1∶2比例传代，每3d半量换液，约7d传代1次。应用免疫荧光法对RSC及对照组神经干细胞进行鉴定。分别应用多聚赖氨酸处理的玻片进行细胞爬片，取出玻片，以0.1mol/L PBS冲洗1次，应用40g/L多聚甲醛固定20min，以PBS冲洗5min×3次，2g/L Triton 100作用10min，0.1mol/L PBS洗4min×3次，加入血清室温封闭20min，倾去血清，加入一抗 (1∶100)孵育过夜(4℃)， PBS洗3次，每次5min。空白对照用PBS代替一抗。加入FITC标记的羊抗兔抗体，避光室温放置30min，0.1mol/L PBS洗3次，每次5min。中性树脂封片，荧光显微镜下观察。另取孕18d大鼠，脱颈处死后浸泡于750mL/L乙醇5min。用碘酊及750mL/L乙醇进一步消毒小鼠腹部，无菌器械剪开孕鼠腹部皮肤，取出受孕的子宫，移入呈有PBS液的培养皿中。PBS液冲洗两遍，剪开离体的子宫，取出胚胎，应用眼科剪剪开头骨，小心将脑组织移入另一培养皿中，应用DMEM/F12培养液冲洗，去除脑膜及血管，并应用微观剪刀将组织剪碎，移入加有1mL 2.5g/L含有EDTA的胰蛋白酶的离心管内，置于37℃下消化15min，每5min振荡1次。加入含有100mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养液终止消化，离心弃上清，应用无血清DMEM/F12培养液洗涤1遍，200目筛网过滤，制成单细胞悬液，以密度为109 /L将细胞接种于6孔板中，培养条件同RSC。收集第2代RSC及神经干细胞，应用含100mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养液诱导分化，37℃，50mL/L CO2、饱和湿度条件下培养，倒置显微镜下观察其分化情况。
2结果
2.1大鼠视网膜干细胞
分离培养48h后开始在组织块旁出现细胞团，大小不一，由数个单个细胞构成，折光性强，呈球形或者桑葚状悬浮生长(图1A)。培养至4～5d后，悬浮生长的细胞团数量逐渐增多、增大。原代细胞培养至6～7d细胞团数量达到高峰。传代时去除组织块及杂细胞，48h即可形成新的细胞团，形态与原代相似，随传代次数增加细胞团数目增加逐渐变缓。取第2代RSC及神经干细胞进行nestin免疫荧光染色，镜下可见RSC呈现阳性的绿色荧光，空白对照组无荧光显示(图2A)。神经干细胞nestin免疫荧光染色亦显示出阳性绿色荧光，与RSC表现相似，空白对照组无荧光显示(图2B)。
2.2大鼠神经干细胞
胎鼠脑组织细胞悬液培养孔内可见培养48h后多数细胞团形成，折光性强，呈球形或者桑葚状悬浮生长(图1B)。培养至4～5d后，悬浮生长的细胞团数量增多，出现较大的细胞团，细胞团间可见融合现象。原代细胞培养至6～7d细胞团数量达到高峰。传代后48h形成新的与原代相似的细胞团。与RSC相比，其细胞团增殖速度较快。图3干细胞体外诱导分化为神经样细胞(IM×100) A:视网膜干细胞;B:神经干细胞。
2.3干细胞体外的诱导分化
取第2代RSC及神经干细胞应用含100mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养液进行诱导分化， 3d可见大部分RSC贴壁生长，部分细胞开始长出小突起， 7～10d细胞突起逐渐增长成条状，呈典型的神经元形态(图3A)。第2代神经干细胞的表现与RSC相似，但其细胞形成突起更为明显，其具有神经元外观的细胞较RSC增多，且细胞之间连接成网状(图3B)。
3讨论
在以往的研究中，人们发现在部分脊椎动物的视网膜边缘，接近睫状体上皮的结合部存在着少量的RSC。在鱼和两栖类动物中，RSC可终生不断生长，持续产生前体细胞，在原有视网膜的周边产生新的视网膜，并可在视网膜损伤时增殖、分化以修复更新受损细胞。此外，人们发现在鸟类视网膜周边部的睫状边缘带也存在着不断增殖分化的RSC，但其产生新生视网膜的能力受到限制[1]。以往认为，哺乳动物中缺乏RSC，近年来的研究证实，胚胎鼠视网膜包含着在体外具有干细胞特性的祖细胞，这些细胞除可增殖并表达神经外胚层标记外，还具有多向分化潜能[2]，而且随着研究的不断进展，目前，研究者们已成功的从多种成年哺乳动物及人类的睫状体区域分离、培养出RSC。这些培养的细胞具有可自我更新、增殖的能力，在一定条件下可分化成为神经细胞、光感受器细胞等某些类型的视网膜细胞[36]，而且近年来研究证明经某些特定基因修饰后视网膜细胞将向特定类型的视网膜细胞分化[79]，RSC的研究进展为视网膜发育的具体机制研究及视网膜损伤疾病治疗带来了希望。
存在于睫状体色素上皮层的RSC由于数量少、部位隐匿，给分离、培养带来一定的困难。目前对RSC仍没有固定的分离培养方法，其培养条件多与脑源性神经干细胞相似，为了抑制干细胞分化常应用无血清培养基，常用的培养基为DMEM/F12(1∶1)。为保证培养细胞持续增殖、更新、保持去分化状态，还需要有丝分裂原(常用bFGF及EGF)。而且，还可添加培养神经细胞所需的多成分复合营养物质B27或N2以促进细胞生长。目前RSC的分离培养方法主要应用机械酶消化法，即先将组织剪成小块，再应用胰酶等酶类进行消化，最终得到单细胞悬液。但在酶消化过程中，为防止消化过程中细胞损伤，很难把获取组织块完全消化成单细胞，因此有时消化所获得的目的细胞较少。我们应用眼科微观剪刀将组织尽量剪成小块，直接置入培养皿内并加入培养基进行培养，避免了酶消化对于细胞的损伤，而且简化了操作步骤，减少了细胞的流失及实验污染的机会。培养48h即可发现较小的组织块周围开始不断有细胞迁移出来，而且在首次传代时用吸管吹打就可获得较多的单细胞，然后再用滤网过滤即可除去杂质，得到较为纯净的细胞团。本实验证明，应用组织块培养法从睫状体区分离、培养出的细胞团具有自我更新及增殖的能力，且免疫荧光法证实其与脑源性神经干细胞相似，均表达神经干细胞标记物nestin，传代后细胞的增殖潜能及nestin的表达无明显衰减。细胞在去除生长因子且存在血清的培养条件下与脑源性神经干细胞表现相似，可诱导分化成具有神经细胞形态的细胞，体现了其在一定条件下具有分化能力。因此，我们认为，组织块培养法适合于来源于睫状体区视网膜神经干细胞的分离培养，可以从少量实验标本中较为简单、快捷的体外扩增出大量的细胞数目以进行进一步的深入研究。
参考文献
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篇5
【中图分类号】R414.1【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2010)009-0010-01
骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells, BMSCs)是一类具有分化潜能的成体干细胞,在特定条件下可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肝细胞、神经细胞等多种细胞,被认为骨组织工程中的最佳种子细胞。本实验通过贴壁培养法和密度梯度离心法分离成年大鼠骨髓基质干细胞,定向成骨分化,并检测细胞表面标志、碱性磷酸酶活性和细胞矿化作用。
材料和方法
1 材料
1.1 实验动物。成年wistar 大鼠,雌雄不限,体重150~180 g ,由浙江大学华家池动物实验中心提供。
1.2 实验试剂。胎牛血清,胰蛋白酶(Hyclone),(杭州四季清生物技术有限公司),B一甘油磷酸纳(Sigma,USA),地塞米松(Sigma,USA),维生素C(Sigma,USA),小鼠抗大鼠OC单克隆抗体(R-D,USA),兔抗大鼠CD4(BA0532)、CD44(BA0321)、CD54(BA0541)、CD105(BA1725)、Fibronectin(BA1772)、Collagen Ⅰ(BA0325)、EGFR1(B0485)亲和纯化抗体(武汉博士德公司)
2 方法
2.1 BMSCs的分离和培养:成年wistar大鼠麻醉后处死,无菌条件下取股骨.用含10%FBS的高糖DMEM培养液冲洗骨髓腔.制成骨髓单细胞悬液。接种于培养皿中,置37℃、5%CO2培养。于72h半量更换培养液,以后每3d半量换液1次。加入成骨诱导培养液进行分化培养.对照组加入等量基础培养液。
2.2 免疫细胞化学检测rBMSCs的表面标志: 取生长良好的3~5代rBMSCs以1.2×105/ml细胞悬液以1ml接种于盖玻片,待细胞单层融合至65%左右时,细胞爬片采用SP检测。
2.3 rBMSCs成脂向诱导分化:取生长良好的3~5代rBMSCs接种培养,贴壁24h后换用成脂诱导剂,取诱导30d后的细胞进行苏丹Ⅳ染色。
2.4 rBMSCs骨向诱导分化:取生长良好的3~5代rBMSCs接种培养,贴壁24h后换用成骨诱导剂,取诱导15d、30d后的细胞进行矿化结节染色。
3 结果
3.1 原代培养的BMSCs接种24h后,即出现零星贴壁细胞。72h后开始增殖,生长良好,贴壁较均匀。BMSCs呈纺锤状,有突起。约10d时,细胞汇合成片,其融合率可达到80%~90%,有接触抑制现象。
3.2 rBMSCs表达出许多的非特异性的表面标志物。DAB显色CD44、CD54、CD105、Fibronectin、Collagen Ⅰ、EGFR1阳性,CD34阴性。
3.3 rBMSCs脂向诱导分化培养中细胞形态出现明显的变化:扁平,多为原盘状,可见细胞突起。细胞诱导10d后胞浆中出现致密的黑色点状物,被大量的“小白点”状的脂滴前体分割。14d后,出现少量高折光性脂滴,随着时间推进,不断增多并形成大脂滴。绿色滤光片下可见清晰的脂滴;苏丹Ⅳ染色显示红色脂滴。
3.4 rBMSCs骨向诱导分化培养中,诱导15d就有较多高折光性小颗粒沉积,并可见局部融合,30d时,可见大量结节,几乎覆盖整个细胞层。
4 讨论
骨髓基质细胞又被称为“间充质干细胞”或“骨源性干细胞”。近年来研究发现还可以分化为星形胶质、少突胶质细胞及神经元,所以又称为多潜能成体干细胞。分离骨髓间充质干细胞有多种方法:免疫磁珠分离法[1]和流式细胞仪法[2]因费用高、需骨髓量大、操作复杂而较少应用。全骨髓法[3]即贴壁细胞分离法虽方法简单但所获细胞纯度不高;密度梯度离心法[4]是根据骨髓中各细胞成分比重不同离心分离培养,简单易行,所获得的细胞纯度较高。
本实验选用密度梯度离心法分离培养的细胞经过3~5代的传代,细胞形态趋于一致;免疫荧光检测显示培养的细胞CD44、CD54、CD105、Fibronectin、Collagen Ⅰ、EGFR1阳性,CD34阴性。于文献报道[5]相一致。虽然这些不是特异性的细胞表面标志物,但可以用以鉴别参考。
多向分化潜能是骨髓基质干细胞最重要的生物学特性[6~7]。本研究表明分离培养的细胞在体外诱导的情况下,既可以诱导为脂肪细胞,又可以诱导成为成骨细胞。因此,体外诱rBMSCs骨向分化可以很好地模拟骨髓基质干细胞向骨祖细胞、成骨前体细胞、成骨细胞、骨细胞分化的整个过程,是体外研究成骨功能及骨代谢的理想细胞生物模型。
参考文献
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篇6
目的 ：研究糖尿病是否会导致在体外培养条件下自体骨髓间充质干细胞的增殖、分泌和抗凋亡能力的改变。方法：利用链脲佐菌素（STZ）诱导制作成年大鼠糖尿病模型（n=6），正常大鼠作为对照组（n=6），分别于体外利用全骨髓贴壁法来扩增和纯化骨髓间充质干细胞后，取生长良好的第2代细胞作为本实验的研究对象。采用Cell Count kit-8（CCK-8）分别绘制两组细胞的生长曲线来评价增殖能力；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血管内皮生长因子（VEGF）和胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的分泌量；应用Hoechst33342染色和膜联蛋白V/PI双染流式细胞术观察细胞在低氧无血清条件下的抗凋亡能力。结果：来源于糖尿病大鼠的骨髓间充质干细胞的增殖较正常的大鼠显著性减慢（P
【关键词】 糖尿病 间充质干细胞 VEGF 细胞凋亡 增殖 大鼠
Abstract: Objective: To study the effect of diabetic inner environment on the biological properties of marrow mesenchymal stem cells derived from bone(BMSCs). Methods: BMSCs were harvested from the normal and diabetic rats induced by streptozotocin (STZ). Cell proliferation was evaluated using cell counting kit-8 (CCK-8) assay. The secretory volume of vascular endothelial growth factor (VEGF) and insulin-like growth factor (IGF-1) were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and the anti-apoptosis capacity of the cell under the hypoxia and serum deprivation (hypoxia/SD) was detected by Hoechst33342 staining and annexin V/PI dual-color flow cytometry. Results: BMSCs from the diabetic rats induced by STZ could be successfully harvested and expanded in vitro. However they showed more spread-out and flattened appearance and larger size. The proliferative ability of diabetic rats derived from BMSCs were significantly decreased compared with the normal rats (P
Key words: diabetes；mesenchymal stem cells；vascular endothelial growth factor；apoptosis；proliferation；rats
干细胞治疗心肌梗死已被证实是一种较有前景的治疗方法。骨髓间充质干细胞（bone mar-row mesenchymal stem cells，BMSCs）由于具有取材容易、体外增殖能力强、低免疫原性、可分化为不同类型的成熟细胞等优点[1-2]，成为最佳的移植细胞来源。但是和其他体细胞类似，BMSCs也易受各种因素如：年龄、氧化应激和高糖[3-4]等的影响而导致其生物学性状改变。
糖尿病患者复杂的体内环境，包括长期的高血糖、高血脂、酮体的增多、活性氧等，势必会对自身体内的BMSCs产生影响[5-6]。目前国内外在干细胞治疗心梗的研究中，大多采用正常或者年轻的BMSCs作为移植细胞来源。为了确定糖尿病体内环境对BMSCs的影响以及其能否作为自体移植的细胞来源，我们将以糖尿病大鼠来源的BMSCs作为研究对象，在体外培养条件下进行一系列的生物学特性检测，就此问题进行初步探讨。
1 材料和方法
1.1 动物
220 g Spraque Dawley(SD)大鼠由温州医学院实验动物中心提供，所有研究都经温州医学院实验动物委员会批准。
1.2 主要试剂
DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清购自Gibco公司；链脲佐菌素（STZ）、Hoechst 33342购自Sigma公司；细胞低氧培养盒、缺氧催化剂购自BioM6rieux-sa(France)；膜联蛋白 (annexin)-V FITC细胞凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物公司；酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自R&D公司。
1.3 糖尿病大鼠模型的制备
12只健康的SD大鼠随机平均分为两组，分别为糖尿病组和正常对照组。两组大鼠在禁食12 h后分别予单次腹腔注射STZ柠檬酸缓冲液(55 mg/kg)和柠檬酸缓冲液。3 d后剪尾静脉测血糖，以>16.67 mmol/L视为糖尿病模型成功，腹腔注射后3周复测1次尾静脉血糖和体重，以确保血糖浓度>16.67 mmol/L。糖尿病模型合格的和正常对照组大鼠继续饲养10周，为下面实验做准备。
1.4 骨髓间充质干细胞的分离和培养
无菌条件下分别剥离糖尿病大鼠和正常对照大鼠的股骨和胫骨[3]，以全骨髓贴壁法分离并培养BMSCs，待状态良好的第二代细胞生长达到70%～80%汇合时可用于以下实验。
1.5 细胞增殖能力检测
取生长良好的第二代骨髓间充质干细胞，于96孔板的每个孔中加入100μL细胞悬液，细胞数为1.5×103，培养基每2天更换一次。于细胞接种后的7 d内，每天取5个孔进行检测，每个孔内加入CCK-8试剂10μL，置培养箱内孵育4 h后，用全自动酶标仪检测490 nm（参比波长630 nm）的吸光度值（OD值），取平均值，以培养时间为横坐标，以相应的OD值为纵坐标，描绘生长曲线。
1.6 间充质干细胞凋亡的检测
1.6.1 细胞模拟缺血处理(无血清和低氧联合处理)：当第二代细胞生长达到70%～80%汇合时用PBS冲洗2次，加入不含胎牛血清的DMEM培养基，然后迅速将细胞放入密闭低氧罐中，置于37 ℃、5% CO2 细胞培养箱内培养6 h。
1.6.2 形态学检测：将进行低氧和无血清处理后的细胞用PBS洗1次，然后加入含Hoechst33342的无血清DMEM培养基，Hoechst33342终浓度为0.1 mg/mL，室温避光反应10 min。用荧光显微镜观察，紫外光激发，观察凋亡细胞并摄片。
1.6.3 流式检测：取经低氧无血清处理的7×105个细胞，用0.125%胰蛋白酶/0.04% EDTA消化细胞后，4 ℃，以800 r/min离心4 min后，弃掉上清液；细胞用PBS冲洗1次后悬浮于200μL结合缓冲液。然后加入10μL 20μg/mL的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的膜联蛋白V(膜联蛋白-V-FITC)，轻轻混匀后，4 ℃避光反应15 min。加入5μL 50μg/mL的PI，300μL结合缓冲液，轻轻混匀，用流式细胞仪检测活细胞、早期和中晚期凋亡细胞及坏死细胞所占的比例。
1.7 血管内皮生长因子（VEGF）和胰岛素生长因子-1（IGF-1）的ELISA检测
将生长良好的第二代骨髓间充质干细胞用PBS冲洗1次后，添加不含血清DMEM培养基置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱内培养6 h后，取上清液备用。按照ELISA试剂盒操作说明书，用双抗体夹心法分别检测细胞培养上清中VEGF和IGF-1的含量，每份标本设3个复孔。用全自动酶标仪测450 nm处吸光度值，取其平均值，根据所绘制的标准曲线计算出各个细胞因子的含量。
1.8 统计学处理方法
采用独立样本t检验。
2 结果
2.1 大鼠BMSCs的培养和增殖能力检测
采用常规细胞原代培养法，成功培养了糖尿病大鼠的BMSCs。相差显微镜下对细胞形态进行了观察，如图1A所示培养的原代细胞呈长梭型，集落生长，中间较密，夹杂着圆形高亮未贴壁的杂细胞，但是糖尿病大鼠的BMSCs所形成的集落较正常大鼠的明显要小，而且贴壁后4~5 d才表现出成纤维样生长特性。细胞传代后，在第1代和第2代细胞生长呈现明显的漩涡状，但是相对于正常大鼠BMSCs饱满的细胞形态，糖尿病大鼠的则表现为细胞伸展无力，且较为扁平。本实验所用细胞均为第2代BMSCs。利用CCK-8检测的结果显示(见图1B)，糖尿病来源的骨髓间充质干细胞增殖能力明显较正常来源的低（P
2.2 VEGF和IGF-1的分泌量
ELISA结果（见图2）显示糖尿病大鼠来源BMSCs的VEGF和IGF-1的分泌量较正常来源的明显降低(分别为P
2.3 细胞凋亡
在缺血无血清联合处理后(图3A)，相差显微镜照片可以显示明显的细胞凋亡表征，即胞核皱缩变圆，贴壁细胞数量明显地减少。Hoechst33342染色后，正常细胞核呈弥散均匀的荧光， 而凋亡的细胞， 细胞核与细胞质中可见浓染致密的颗粒荧光， 被认为是典型的凋亡细胞。
2.4 膜联蛋白V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡膜联蛋白
糖尿病来源的BMSCs中早期凋亡细胞(膜联蛋白为V+/PI-）较正常大鼠来源的明显增多（P 0.05）。
3 讨论
随着冠心病发病机制研究的深入，更多的证据表明，作为代谢综合征之一的糖尿病和冠心病的发生有着密切的关系[5]。而糖尿病患者体内的高糖、酮体、氧化产物等有害物质的增多，势必对自体来源的BMSCs的性状产生影响。在本研究中我们通过利用STZ诱导糖尿病大鼠模型，在经体外培养后发现，糖尿病来源的BMSCs在增殖能力上明显减弱，并且在细胞的分泌和抗凋亡能力上也较正常大鼠来源的显著降低。
在BMSCs治疗心肌梗死的研究中，首先要在体外扩增得到移植所需的细胞量。我们在研究中发现，在原代培养中糖尿病来源细胞在贴壁后4～5 d才表现出成纤维样生长的特性，且糖尿病来源的BMSCs的增殖能力明显降低，并且细胞较为扁平。原代体外贴壁时间的延长和细胞形态的变化说明其对环境的适应能力降低，需要较长的时间来恢复其生长增殖能力。另外有研究表明，传代后细胞变为扁平，具有这样的形态特征为细胞衰老的表象[7]，并且与我们所得出的增殖能力的下降是相一致的。
另外在BMSCs移植提高梗死后的心功能上，干细胞所分泌的细胞因子被认为是提高心功能的主要因素之一[8]，其中VEGF和IGF-1在促进新生血管的生成和细胞增殖方面起着非常重要的作用。我们的研究表明，糖尿病来源的BMSCs其VEGF和IGF-1分泌量较正常来源的明显降低。Liu等[9]利用高糖培养多功能前体细胞后，VEGF的分泌量也可以得到类似的结果，但是其细胞来源为正常的幼年大鼠。在本实验中所采用的干细胞培养条件为正常的培养条件，说明糖尿病的体内环境对糖尿病来源的干细胞其分泌能力有不可逆的损害作用。另据研究表明，VEGF和IGF-1在糖尿病患者的肾脏和视网膜以及血液中的浓度明显高于正常水平[10]，但是糖尿病自身来源的BMSCs所分泌的VEGF和IGF-1较正常的明显降低，造成这种矛盾的结果，可能是不同的组织来源的细胞对于糖尿病内环境的反应性不同，并且VEGF和IGF-1在糖尿病肾病和视网膜病变等糖尿病并发症的发展中起着重要的作用。至于细胞移植后分泌的细胞因子，是否会加速糖尿病并发症的发展进程，需要更深入地研究。
影响干细胞治疗心梗疗效的另一重要因素是在干细胞移植后细胞在心梗区的存活率较低，而心肌梗死区缺血低氧的环境是导致细胞凋亡的主要原因。我们采用体外低氧无血清的方法建立细胞凋亡模型[11]，发现糖尿病组的抗凋亡能力明显较正常组下降。现有的体外研究表明，体外的高糖、丙酮醛类、活性氧产物（ROS）等环境对细胞的凋亡起着很大的促进作用，而这些因素在糖尿病患者中均存在。另外，VEGF的分泌减少和糖尿病BMSCs在体外培养条件下的所表现出细胞衰老的形态学特征，抗细胞凋亡能力的下降也起着重要的促进作用。
目前关于糖尿病大鼠来源的BMSCs在增殖、分泌和抗凋亡能力下降方面的确切机制目前尚不清楚，可能与糖尿病体内复杂的病理生理条件造成干细胞的线粒体功能障碍[12]、高糖所导致的细胞复制性衰老[3]和相应的信号通道阻断等有关[9]。在本实验中，我们选择均为同龄的大鼠作为实验对象，避免了因年龄不同而造成的误差；在细胞培养方面，均在体外正常的培养条件下进行，从而可以得出糖尿病对BMSCs的各种生物学性状的损害是客观存在的。
本研究也存在若干不足，如没有将培养得到的糖尿病BMSCs移植回动物心梗模型体内，检测其对心功能的改善情况。另外，在糖尿病来源的BMSCs在抗凋亡能力、增殖能力和分泌能力损伤的机制上，没有做进一步的探讨，这也是我们下一步实验的方向。
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篇7
摘要：目的研究黄芩茎叶总黄酮（SSTF）对乙醇损伤小鼠原代培养肝细胞的保护作用。方法采用胰蛋白酶消化、分离小鼠肝细胞进行原代培养，乙醇体外诱导肝细胞损伤，以不同浓度的SSTF对肝细胞保护，检测培养液中丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性和肝细胞内丙二醛（MDA）含量，MTT法测肝细胞存活率。结果SSTF（100，200，300 mg・L-1）明显改善肝细胞存活率，抑制乙醇引起的ALT活性的升高，对肝细胞中MDA含量的升高有明显的抑制作用。结论SSTF对乙醇损伤的小鼠肝细胞有明显的保护作用，其机制可能与SSTF的抗氧化作用有关。
关键词：乙醇； 肝细胞； 原代培养； 黄芩茎叶总黄酮； 保护作用
The Protective Effect of Total Flavonoid in scutellaria baicalensis Stem-Leaf on Primary Cultured Mice Hepatocytes Injured by Ethanol
Abstract：ObjectiveTo study the protective effect of total flavonoid in Scutellaria baicalensis stem-leaf (SSTF) on primary mice hepatocyes injured by ethanol. MethodsPrimary hepatocytes were isolated， cultured by trypsin digestion and induced by ethanol. Various concentrations of SSTF were added to the primary cultured hepatocytes for 12h.The content of malondialdehyde(MDA) in hepatocytes and the activity of ALT in cultural supernatant were determined by general methods，the viabilities of hepatocytes were measured by MTT.ResultsThe elevation of MDA content of hepatocytes and ALT level in supermatant of cultural hepatocyes were restored remarkably by SSTF， hepatocytes viability was improved significantly by SSTF.ConclusionSSTF has a protective action on primary mice hepatocyes injured by ethanol.This might be associated with its anti-lopoperoridation.
Key words：Ethanol; Hepatocytes; Primary cultured; SSTF; Protective effect
肝脏是酒精代谢的主要脏器，过量饮酒可造成肝脏不同程度的损害，并进一步发展为脂肪肝、肝纤维化和肝硬化，严重危害人类健康。了解酒精性肝损伤的发病机制，筛选有效预防和治疗的药物应用于临床，是当前面临的重要课题。黄芩茎叶总黄酮(SSTF)是我院中药所对黄芩的茎叶部分提取的有效成分，整体实验已证实其对肝损伤有保护作用［1］。本文建立体外乙醇性肝细胞损伤模型，在细胞水平上进一步研究乙醇性肝损伤的机制及SSTF对肝细胞保护作用机制。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂SSTF（含总黄酮73%）：承德医学院中药研究所提供，临用前以蒸馏水配制，用饱和碳酸氢钠调pH=7.6；Hanks液高压灭菌，4℃保存；0.8 g・L-1胰蛋白酶：用Hanks液溶解，过滤除菌，调pH 7.2，分装，-30℃保存；基础培养液：RPMI 1 640培养基10.0 g，用超净水900 ml溶解，5.6%NaHCO3调pH至7.2，定溶到1 000 ml，过滤除菌，临用前每80 ml，加入新生小牛血清20 ml，青霉素100 u・ml-1，链霉素100 μg・ml-1，胰岛素5 μg・ml-1；MTT：SIGMA公司；ALT，MDA测定试剂盒:南京建成生物工程研究所。
1.2 动物昆明种小鼠，1~3 d龄乳鼠，雌雄不限，清洁级，承德医学院实验动物管理中心提供。
1.3 仪器CO2培养箱（Taibai LNA-122D 日本），MD-100半自动生化分析仪（美国Bayer公司），721W微机型分光光度计（上海光学仪器五厂），离心机（TGL.16G 上海）。
1.4 肝细胞分离培养［2］取新生小鼠30只，断头放血，无菌分离肝脏，置Hanks液中，灌注冲洗肝脏至灰白色，将肝脏剪成1 mm3左右的组织块，用Hanks冲洗数次，除去血细胞，加入0.8 g・L-1胰蛋白酶10 ml，37℃孵育12 min，加入数滴血清终止消化，用滴管轻吹打成细胞悬液，经200尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，1000 r/min离心5 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>85%，按1 ×109个・L-1，接种于铺有鼠尾胶原的24孔和96孔板中，37℃，5%CO2条件下培养。
1.5 乙醇诱导肝细胞损伤模型的建立将含肝细胞培养液的96孔板培养24 h更换培养液，设正常对照组，25，50，75，100 mmol・L-1四个乙醇组，肝细胞悬液与不同浓度乙醇继续培养12 h，取培养液按赖氏法测定ALT活性，TBA法检测MDA含量，MTT法测定肝细胞存活率。
1.6 SSTF对诱导肝细胞损伤的作用取上述培养24 h肝细胞，设乙醇损伤模型组、SSTF(100，200，300 mg・L-1)3个剂量保护组、正常对照组，每组设8个复孔。模型组和SSTF组加入乙醇100 mmol・L-1，同时SSTF组加入不同浓度的SSTF，正常对照组加不含血清的培养液，继续培养12 h，收集培养上清液检测ALT活性和MDA含量，MTT法测定肝细胞的存活率。
1.7 统计学处理数据以±s表示，用SPSS11.5计算机软件进行统计学分析， 组间比较采用t检验，P
2 结果
2.1 乙醇对原代培养肝细胞的损伤不同浓度的乙醇作用于肝细胞，对细胞有剂量依赖性的损伤作用，25 mmol・L-1作用不明显，光镜下细胞形态基本正常，随着浓度的增大，肝细胞存活率呈进行性降低，反映肝细胞损伤的酶ALT逐渐升高；镜下观察肝细胞损伤明显，细胞结构不清，核融解和核膜破裂，其中100 mmol・L-1乙醇作用最明显。
表1 不同浓度乙醇对肝细胞ALT水平及细胞存活率的影响（略）
与空白对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；n=6
2.2 SSTF对乙醇损伤肝细胞的保护作用100 mmol・L-1乙醇作用肝细胞后，肝细胞损伤明显，大量细胞坏死，细胞内ALT释放量明显升高，细胞内MDA含量较对照组明显增高；而给予SSTF保护后， ALT水平明显降低，MDA含量亦明显降低，肝细胞存活率明显升高，并呈现剂量依赖性(P＜0.05或P＜0.01)。显示：SSTF能够保护肝细胞、稳定肝细胞膜的结构，其保护作用可能与抗脂质过氧化作用有关。
表2 SSTF对乙醇损伤肝细胞ALT，MDA水平及细胞存活率的影响（略）
与对照组比较，*P＜0.01，与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；n=6
3 讨论
乙醇本身和它的氧化物乙醛对肝细胞有直接毒性作用［3］。乙醇进入机体后，在肝细胞乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶、细胞色素P450等作用下产生氧自由基，氧自由基除直接损伤肝细胞外，还可通过增加肝细胞对脂质过氧化的敏感性，导致细胞膜和细胞器破坏，肝酶逸出，细胞死亡［4］。ALT是肝细胞内主要酶之一，肝细胞膜损伤时，细胞内ALT释放量增加，因此检测培养液中ALT活性是判断肝细胞膜损伤最明显的标志［5］，MTT法检测细胞存活情况可直接反映细胞损伤程度，MDA是肝细胞脂质过氧化的最终产物，其含量高低可反映膜脂质过氧化程度的强弱和肝细胞损伤的程度［6］。我们在研究中发现，低剂量酒精对肝细胞损伤不明显，ALT水平和MDA含量变化不大，随着酒精浓度的增加，细胞培养液中ALT呈进行性升高，细胞存活率逐渐下降，并且MDA含量也呈现进行性增加，表明过量饮酒可引起肝细胞氧化损伤。为了充分证实SSTF对酒精性肝损伤的保护作用，我们以100 mmol・L-1乙醇制备小鼠肝细胞损伤模型。结果表明，在酒精损伤的肝细胞中加入SSTF后，肝细胞损伤明显减轻。随着SSTF剂量增加，培养液中ALT水平逐渐降低，肝细胞存活率明显升高，与模型组比较，差别显著（P
参考文献
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［3］ Sergent O，Pereira M，Belhomme C，et al.Role for membrane fluidity in ethanol-inducde oxidative stress of rat hepatocytes［J］. J Pharmacol Exp Ther，2005，1:5.
［4］ Hock J B，Pastorino J G.Ethanol，oxidative stress，and cytokine-induced liver cell injury［J］.Alcohol，2002，27(1):63.
篇8
胚胎干细胞（ES细胞）是具有全能性的哺乳动物早期胚胎细胞或原始细胞。胚胎干细胞在分化抑制的培养条件下，可以未分化状态无限增殖。近年来有关牛类ES细胞分离与克隆的研究已经取得较大进展[1-2]。笔者为探讨添加物和消化液对牛胚胎干细胞克隆效率的影响，通过从牛鲜胚内细胞团（ICM）中分离获得牛类ES细胞后进行克隆，在培养细胞中添加胰岛素生长因子和消化液，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 牛胚采集 在自然期，对健康经产黑白花奶牛母进行人工受精后68 d经非手术方法从牛子宫取胚胎。将待采集胚胎的母牛固定在床位上，在尾椎硬膜外腔注射 2% 盐酸利多卡因麻醉。按规定方法在冲洗两侧子宫角。冲出的胚胎要在立体显微镜下检查。在100倍实体解剖显微镜下观察受精卵的形态、色调、分裂球的大小、均匀度、细胞的密度、与透明带的间隙以及变性情况等[3-4]。
1.2 溶液配制 细胞基础培养液：DMEM+0.1 mM 2-mercap-toethanol（在此基础上，添加不同浓度的血清及各种细胞因子）；细胞基础消化液：胰蛋白酶+EDTA（在此基础上，两者浓度有所调整）。
1.2.1 饲养层制备 选取新生健康黑白花牛犊制备成纤维细胞，取3代内对数生长期MEF， 终浓度10μg/ml 丝裂霉素C处理 3.5 h， D-PBS充分洗涤，消化细胞调整细胞浓度为1×105个/ml，种植在经 0.1%明胶包被的4孔培养板中，置37 ℃、5% CO2培养箱培养待用，用前更换成胚胎干细胞培养基。
1.2.2 胚胎处理和胚胎培养条件 基础培养液为DMEM培养基+15%NBS+0.1mmol/L 0.1 μmol/L Na2SeO3+β琉基乙醇。室温下培养牛胚胎及ES细胞。
1.2.3 ICM初次传代 将ICM细胞体外培养6～7 d后，当细胞繁殖到一定数目时，选择未分化的细胞进行传代。操作如下：用玻璃针剥离覆盖在ICM表面的滋养层细胞后挑出ICM，用PBS洗涤液清洗后，置入0.02%EDTA消化液+0.125%胰蛋白酶消化液中处理后，将细胞转入15%的血清培养液中，制备细胞团悬混液。培养条件同上。
1.2.4 牛ES细胞继代克隆 ICM细胞培养35 d后，饲养层表面可出现类似ES细胞的集落。弃去培养液，用PBS液洗涤集落，再用玻璃针剥脱隆起明显、排列紧密的ES细胞集落，再用毛细吸管将集落移入培养液中。
1.3 研究方法 在DMEM培养基中加入10 ng/ml的IGF（设为IGF组）观察牛ES细胞的克隆结果与未加IGF（设为对照组）时做比较，在离散ICM和ES集落时，分别用0.02%EDTA消化液+0.125%胰蛋白酶消化液（A组）和0.04%EDTA消化液+0.25%胰蛋白酶消化液（B组），作用时间控制为2 min，温度37 ℃。
1.4 统计学处理 采用SPSS 16.0统计学软件对数据进行统计处理，计数资料采用 字2检验，以P
2 结果
不同条件对牛ES细胞克隆的影响情况，具体结果见表1。
3 讨论
胚胎干细胞具有全能性，能再体外条件下分化为各器官系统细胞，亦可在分化抑制的情况下进行未分化状态克隆，胚胎干细胞克隆技术广泛运用于转基因动物、嵌合体的制作和克隆动物的生产，目前有关牛胚胎克隆的研究取得了重大进展[4-5]。为探讨不同条件对牛ES细胞克隆的影响，笔者探讨了在不同浓度消化液及在胰岛素生长因子作用下，牛ES细胞克隆的变化。牛ES细胞在以上配置的培养液中培养形成ES细胞集落胚数/枚ES 2枚，细胞最大传代数2代。在培养液中加入10 ng/ml的IGF牛ES细胞集落胚数为3枚，细胞最大传代数4代，可见IGF对牛ES细胞克隆有促进作用。在ICM细胞与ES细胞分离时用0.02%EDTA消化液+0.125%胰蛋白酶消化液处理2 min，形成ES细胞集落胚数/枚ES 9枚细胞最大传代数4代。用0.04%EDTA消化液+0.25%胰蛋白酶消化液分离牛ES细胞集落胚数为8枚，细胞最大传代数4代。因此，在分离ICM细胞和ES细胞时注意，选择适当浓度的消化液，且作用时间不宜过长[6-8]。通过本实验可得出在进行牛ES细胞培养时，可利用一定的添加物促进ES细胞克隆，促进其繁殖，而对于分离ICM和ES细胞的消化液，须严控其浓度和作用时间。
参考文献
[1] 姜景岩，孔北华，刘星霞，等.人胚骨髓基质细胞饲养层对人胚胎生殖细胞生长的作用[J].生殖与避孕，2005，25（3）：131-135.
[2] Munoz M，Rodnguez A，Frutos C，et a1.Conventional pluripotency markers are unspecific for bovine embryonic-derived cell-lines[J].Theriojournal，2008，9（6）：1159-l164.
[3] 张守宝，柏学进，朱金香.不同饲养层对牛胚胎干细胞培养的影响[J].畜牧与兽医，2010，42（5）：45-46.
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篇9
关键词： β细胞素; 糖尿病 胰腺干细胞
胰岛移植是治疗糖尿病的一个热点, 但供体的缺乏和存在免疫排斥反应限制了其应用。胰腺干细胞能定向分化成胰岛细胞, 这为胰岛移植提供了新的材料来源［1］。细胞生长因子在干细胞的发育和分化中发挥了重要作用。研究表明, β细胞素（betacellulin, BTC）属于表皮细
胞生长因子家族中的一个成员, 具有多种生物学功能, 胰腺BTC mRNA的高水平表达, 提示BTC可能在胰腺组织的发育中发挥重要的生理作用［2, 3］。本研究中通过建立稳定的胰腺干细胞体外培养方法, 将β细胞素用于胰腺干细胞的体外培养, 观察其是否能促进胰腺干细胞转分化为成熟的胰岛, 为克服胰岛移植时的供体短缺提供新的胰岛来源。
1 材料和方法
1.1 材料
SD大鼠（体质量250 g, 雌雄不限, 饲养于清洁级动物房自由饮水和进食, 手术前1 d禁饮食）由第四军医大学动物中心提供, Ⅴ型胶原酶、 Histopaque(1.119 kg/L)、Histopaque(1.098)(kg/L)、 Histopaque(1.077 kg/L)、 碱性成纤维细胞生长因子2(basic fibroblast growth factor 2, bFGF2)、 角朊细胞生长因子(keratinocyte growth factor, KGF)、 ITS(insulintransferin selenium)购自Sigma公司; 牛血清白蛋白(BSA) 购自杭州四季青生物制品公司; 双硫腙（dithizone, DTZ）、 二甲基亚砜（DMSO）、 烟碱购
于华美公司; 兔抗小鼠的PDX1和CK19抗体购自北京中山生物工程有限公司; 免疫组化SP检测试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司; CMRL1066、 DMEM/F12 购于Gibco公司; 胰岛素放射免疫分析试剂盒购于北京北方生物技术研究所; 大鼠β细胞素由本研究室采用基因工程方法获得［4］。
1.2 方法
1.2.1 大鼠胰腺干细胞的分离、 培养
采用宋振顺等［5］的方法, 首先以Ⅴ型胶原酶消化成年SD大鼠胰腺组织, 然后采用非连续密度梯度离
心法纯化消化后的胰腺细胞, 去除胰岛细胞后, 收集外分泌部细胞进行培养。所获的细胞培养在含100 mL/L胎牛血清的CMRL1066培养液中, 其中添加100 U/mL青霉素、 100 g/L链霉素、 500 μg/L二性霉素B。第3天将培养液改为DMEM/F12, 其中加入ITS（5 mU/L胰岛素+5 mg/L转铁蛋白+5 mg/L硒）500 μg/L二性霉素B, 2 g/L牛血清白蛋白、 10 mmol /L烟碱, 0.01 ng/L KGF等。此后每2～3 d换液1次。于相差显微镜下观察细胞生长状况和克隆形成情况。
1.2.2 胰腺干细胞免疫组织化学染色
分别取培养3、 7、 14 d后的细胞爬片, 0.4 g/L多聚甲醛(PFA)固定后, PBS缓冲液冲洗玻片, 分别与兔抗小鼠PDX1、 CK19 抗体4℃反应过夜, 二抗及呈色反应参照SP试剂盒说明。二氨基联苯胺(DAB)显色, 显微镜观察, 自来水冲洗, 苏木精复染, 中性树胶封固。阴性对照用PBS代替一抗。
1.2.3 双硫腙染色与计数
双硫腙(DTZ)为螯合剂, 可与铅、 铜、 锌等螯合, 人和动物（豚鼠除外）的胰岛β细胞因含有锌, 双硫腙染色呈猩红色, 其他胰岛细胞不着色。配制及染色方法: 用二甲基亚砜（DMSO）配制: DTZ 10 mg溶于10 mL DMSO, 用Hanks（pH7.8）1∶100稀释, 0.22 μm滤膜过滤, DTZ与胰腺干细胞培养后转分化形成的克隆混合, 室温5～10 min后做镜检。按胰岛的直径>50 μm计数染色的胰岛样细胞团, <50 μm者不计。
1.2.4 胰岛素检测
胰腺干细胞转分化后形成的胰岛克隆对葡萄糖刺激有胰岛素分泌反应。显微镜下挑取100个胰岛样细胞团克隆, 培养于24孔培养板, 先用含低糖（5.5 mmol/L）的DMEM/F12培养液在37℃下孵育1 h后, 更换为含高糖（16.7 mmol/L）加烟碱（10 mmol/L）的DMEM/F12培养液在37℃下孵育2 h后, 取培养液上清, 采用放免法测定胰岛素含量。
1.2.5 实验分组
按照实验方法1.2.1中胰腺干细胞的培养方法培养大鼠胰腺干细胞, 并将其设为正常对照组, 各实验组中分别加入不同浓度的大鼠β细胞素, 依次为10、 20、 30、 40、 50 mg/L, 共设立5个实验组。
1.2.6 统计学处理
采用Student t检验方法, 应用SPSS10.0统计软件完成统计学分析。
2 结果
2.1 成人胰腺导管上皮细胞光镜下形态学变化
篇10
中图分类号：R329 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）21-0308-01
1 无血清培养体系简介
无血清培养体系是在合成培养体系的基础上发展而来的，主要是寻找替代血清的各种可能性，使无血清培养既能进行细胞培养，又可以避免血清带来的不利影响。与含血清培养相比，具有很多的优点，无血清培养技术的发展是从上世纪七十年代开始的，其中基于生产安全性的重组药物而开发的无血清培养基，不用动物做为蛋白来源，降低了成本也加快了报批的速度，后来逐渐发展成为培养基的组成成分全部为化学已知物，更易进行目标蛋白的分离纯化，要求培养的细胞要具有较高的特异性。
一般无血清培养体系由基础培养和替代血清补充因子两部分组成，其中基础培养是零添加血清的合成培养基，按照细胞的生长要求将各种微量元素和营养物质进行合成为基础培养基。补充因子是代替血清的各种因子，包括激素、生长因子、结合蛋白等，在所有的补充因子中，胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠是细胞在无血清培养基中生长所必须的，是必须具备的补充因子。
2 无血清培养体系在再生医学领域的应用
2.1 无血清培养基研制配方的应用
研究人员研究发现在无血清合成输卵管液培养基中加入胰岛素、转铁蛋白和硒，可以提高动物胚胎的发育质量，再加入牛血清白蛋白后，可以促进囊胚的发展，可以促进细胞的增殖实验。CHO、Vero等工程细胞是单克隆抗体和基因工程药物的表达载体，在对无血清培养基的研制时，要满足增殖的需要，同时也要表达目的产物。例如CS-NS0细胞是抗-CD25单克隆抗体的表达体，无血清低蛋白培养基可以满足大规模培养和抗体表达的要求，批培养最大活细胞密度和最大抗体浓度都达到很高。基于人胚肾细胞培养的无蛋白培养基，可以用于对抗聚乙烯介导转染慢病毒，具有较高的滴度，成本也较低。针对Vero细胞源乙型脑炎疫苗而研制的无血清培养基，没有任何动物源性成分，疫苗只要添加稳定剂，就可以在常温下保存。
2.2 无血清培养体系在细胞增殖方面的应用
雌二醇是无血清培养基中经常添加的激素，如果其浓度较高，会抑制毛囊的生长；PDGF、TGF-β、FGF是三种信号通路，可以促进间质干细胞的生长分化，如果其中之一受到抑制作用会影响间质干细胞的生长，如果三种信号通路结合好，则会使间质干细胞在培养基中传到五代。如果无血清培养基钙浓度较低，下调Smad蛋白介导会维持角膜基质细胞的表型，角膜的上皮细胞也可以长期进行传代培养。中草药是我国的传统医学代表，细胞无血清培养技术也影响到中草药的作用机制，研究显示黄芪可以增加人皮肤表皮干细胞将粒酶转化为录酶，并增强其活性。
2.3 无血清培养基在细胞和组织移植中的应用
无血清培养体系安全性较高，所以广泛应用于基于生物细胞培养的细胞或组织移植治疗中。在无血清培养基中培养骨髓基质干细胞，可以获得与含血清培养基相同的增殖效果，如果患者属于特殊贫血类型并且体重较轻，可以诱导人体成骨，并可以抑制异位骨，这方面比含血清培养更具有优势。采用脂质体转染法转染骨髓间充质干细胞，可以在无血清培养的条件下抑制细胞的凋亡，使骨髓间充质干细胞可以存活于下肢缺血性疾病的治疗中。
如果某些细胞和组织具移植的可能性，如果研制的培养基可以长久的维持细胞特性，这将会促进移植的成功率。新鲜刚分离的肝细胞具有特有的分化属性，此属性如果存在于含血清培养基中就会丧失掉，如果在无血清培养基中添加地塞米松、表皮生长因子、垂体提取物等，肝细胞就会保持3-4周的分化属性，这对于需要肝部移植的患者来说，是一大福音。对由幼年牛软骨外植体组成的无血清培养基进行观察后发现，外植体的力学性能和生物含量得到了有效的加强，其性能一直比较稳定，细胞充满活力。含血清基外植体的力学则有所下降，并且损失了一定的聚糖并发。这充分说明了无血清培养基可以延长成熟细胞的特性，在组织互作无血清培养体系中，需要添加特定的材料来介导才能促进上皮间质的互作。
2.4 无血清培养基在肿瘤治疗方面的应用
无血清培养基具有许多优点，包括可以使细胞生存所需的营养物质得到保证，除掉了血清中的促分化剂，对于肿瘤的发现和治疗具有重要的应用价值。无血清培养可以增加SP2/0细胞中的瘤细胞，这些瘤细胞都具有干细胞特性，可以将SP2/0中的肿瘤干细胞进行富集。细胞外基质可以影响肿瘤细胞的存活、增殖和迁移，无血清培养基中加入纤维连接蛋白后来培养人乳腺癌细胞，可以上调基质 金属蛋白酶的活性。单克隆抗体可以阻断整合素，可以抑制基质金属蛋白酶的活化反应。在进行肿瘤治疗时，对体外诱导扩增CIK细胞及抗肿瘤活性进行研究，分别采用无血清培养和含血清培养基，结果显示无血清培养基可以代替含血清培养基，某些方面还有含血清培养没有的优势。研究人员研究了适合于B16黑色毒瘤细胞培养的无血清培养基，对树突状细胞进行预防。这说明无血清培养的免疫活性细胞可以用于肿瘤的生物免疫治疗。
2.5 无血清培养基在外周血淋巴细胞抑制中的应用
抑制外周血淋巴细胞的无血清培养基是一种生物制剂，主要成分是凝集素、基础培养基和血清替代物，其血清替代物包括牛血清白蛋白、重组人胰岛素、柠檬酸铁和氨基酸母液，外周血淋巴细胞培养基不用动物或者人的血清，不仅降低了培养基成本，还可以降低疾病的传播，此淋巴细胞培养基可以增强淋巴细胞的转换率，促进淋巴细胞的分裂，抑制效果显著，可以广泛用于染色体核型的临床诊断，是康复率低的淋巴疾病的福音。
3 小结
无血清培养体系具有含血清培养体系无法达到的优势，但需要在培养通用性、生产高效性以及成本和安全方面进行改进，未来随着对细胞营养、细胞代谢 、细胞凋亡以及外源蛋白表达等的不断研究，采用更多的科学实验方法，可以使无血清培养基的开发更加快捷，使模拟细胞微环境的无血清培养体系可以广泛应用于生物科学领域，特别是再生医学领域，为更多的疑难杂症以及再生性疾病提供更多的服务。
参考文献
篇11
DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2016.32.091
【Abstract】 Objective To briefly research culture， identification and mark of rabbit bone marrow stroma stem cells. Methods Bone marrow cells of young rabbits were cultured by adhesion method for purification by repeated passage， and cell surface antigen was detected by flow cytometry. Bone marrow stroma stem cells marked by 5-bromodeoxyuridine （BrdU） was injected into rabbit brain for immunofluorescent staining of brain paraffin section after 2 weeks. Results Bone marrow cells cultured by adhesion method provided purified cells suitable for long-term culture in vitro. CD31 had negative rate as 5.67%， CD34 had negative rate as 4.31%， CD45 had negative rate as 4.42%， CD44 had positive rate as 98.82%. CD71 had positive rate as 99.17%. CD90 had positive rate as 98.23%. CD31， CD34 and CD45 showed negative outcome， and CD44， CD71 and CD90 showed positive outcome. BrdU was suitable to be taken by bone marrow stroma stem cells in DNA synthesis. Conclusion Adhesion method provides bone marrow stroma stem cells with high purification， and BrdU can be used as ideal marker for in vivo tracking bone marrow stroma stem cells.
【Key words】 Bone marrow stroma stem cells； CD molecule； 5-bromodeoxyuridine
骨髓基质细胞是一种不具有造血功能的细胞， 由于该细胞容易取材， 并且可以体外扩增以及多向分化等优点， 逐渐成为受到广泛研究[1-4]。本文作者主要对兔骨髓基质干细胞的培养、鉴定以及标记作简单探究。
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂 ①材料：本文选择的研究对象为幼兔， 主要来源于内蒙古实验动物中心。②试剂：主要有Gibco生产的胎牛低血清糖DMEM， 由Serotec公司生产的CD71、CD31、CD45mAb， 由Sigma生产的MTT、BrdU， 由Biolegend公司生产的经异硫氰酸荧光素（FITC）标记的CD45和CDmAb， 剩余试剂则由我国生产。
1. 2 方法
1. 2. 1 原代培养骨髓基质干细胞 将幼兔采用脱颈的方式将其处死， 在充分消毒以后取出两侧的股骨， 中断股骨并反复用肝素生理盐水进行冲洗， 主要是将骨髓细胞冲出， 将冲出的骨髓细胞加入至容量为200 ml的LG-DMEM培养液中， 将其在室温为37℃环境中进行培养， 培养2 d后更换一半培养液， 以后每隔1～2 d在更换一半的培养液， 等到7～8 d后便可以实现1次传代[5-8]。
1. 2. 2 骨髓基|干细胞鉴定 将经上述步骤培养出的第六代并且已纯化的骨髓基质干细胞消化， 在计数之后将其倒入离心管内， 使用磷酸盐缓冲液（PBS） 0.01 mol/L洗涤1次， 离心的时间控制在5 min， 离心的转速为800 r/min， 离心成功后， 再将其加入至200 μl的PBS重悬细胞中， 加入FITC分别标记出小兔的CD31、CD34、CD45、CD90、CD44、CD71， 在室温为37℃以及无关的环境下反应1 h， 待反应结果后， 在使用聚甲醛40 g/L进行固定， 最后检测流式细胞数[9-12]。
1. 2. 3 BrdU标记骨髓基质干细胞的体外研究 选择处于对数生长期的骨髓基质干细胞开展细胞爬片， 等到细胞生长到一半时加入BrdU， 待2 d后取出玻璃片用PBS 0.01 mol/L洗涤， 运用多聚甲醛固定好后开展免疫组化和免疫荧光染色， 最后封面进行观察。
1. 2. 4 BrdU标记骨髓基质干细胞的体内研究 在幼兔颅内注射经过BrdU标记的骨髓基质干细胞， 3周后脱颈处死并取出脑， 在穿刺点附近开展石切片后开展免疫荧光染色。具体步骤为：首先， 常规脱蜡至水， 分别用30 ml/L 过氧化氢（H2O2）、2 mol/L 氯化氢（HCl）、4 g/L的胃蛋白酶、10 g/L
牛血清白蛋白室温封闭约10 min， 加入2 mol/L HCl， 室温下孵育30 min， 再将4 g/L的胃蛋白酶室温孵育30 min， 然后兔抗BrdUmAb（1∶100）在湿盒中孵育过夜， 温度为4℃；然后将TRITC标记抗兔免疫球蛋白G（IgG）（1∶100）在室温下孵育40 min， 最后在用PBS和蒸馏水洗涤， 封片观察[13-16]。选择同一个组织切片随机选择6个不同的视野分别计算阳性率， BrdU标记阳性率=6个不同的视野分别计算阳性率/6个视野细胞总数×100%。
2 结果
2. 1 骨髓基质干细胞培养结果 在对小兔骨髓基质干细胞培养的初期， 能够看见很多悬浮的细胞， 再培养2 d后发现了一些形状为纺锤形的贴壁细胞呈分散状态， 在经过数次更换培养液后， 贴壁上的细胞数量不断减少直至消失， 4 d后可以发现贴壁的纺锤细胞数量增加， 并且呈成簇分布， 但是依然含有其他细胞， 但是在经过数次传代培养以后， 混杂细胞逐渐纯化， 细胞初期的以集落增长， 但是在第六代之后均为均匀分布的纺锤形。
2. 2 骨髓基质干细胞的鉴定 经鉴定发现， CD31的阴性率为5.67%， CD34的阴性率为4.31%， CD45的阴性率为4.42%， CD44的阳性率为98.82%， CD71的阳性率为99.17%， CD90的阳性率为98.23%。
2. 3 骨髓基质干细胞体内外标记 将小兔的骨髓基质干细胞免疫组化以后， 结果可以观察到呈棕色的阳性细胞分布， 选择相同的组织片中6个视野不同进行观察， 并将阳性率计算出来， 然后再分别计算不同的标本， 经计算， BrdU标记的细胞所占的比例为87.6%。在运用免疫荧光染色之后发现细胞核染色显著， 但若将BrdU标记骨髓基质干细胞注入体内， 3周以后依然可以看到明显的BrdU着色， 并且在穿刺位置还发现密集的细胞。
3 讨论
骨髓基质干细胞属于一类具有多向分化潜能的干细胞， 当理化环境不同和受到细胞因素诱导时， 可以进一步向成软骨、成骨、脂肪以及纤维细胞系等[17-19]进行多方向性扩增和分离， 并且骨髓基质干细胞还容易被外源基因感染， 因此当前成为基因治疗和组织工程的较理想的靶细胞。因此如何获取并纯化骨髓基质干细胞已经成为医学界研究的重大课题。分离和纯化骨髓基质干细胞的基本原则为细胞的粘附性。当前， 从骨髓中获得基质干细胞常采用两种途径[20]：①为梯度离心法获得干细胞；②为全骨髓细胞培养。
本研究通过贴壁法培养幼年兔骨髓细胞可获得较纯化的细胞， 并能在体外长期培养， 结果提示：骨髓基质干细胞培养在对小兔骨髓基质干细胞培养的初期， 能够看见很多悬浮的细胞， 再培养2 d后发现了一些形状为纺锤形的贴壁细胞呈分散状态， 在经过数次更换培养液后， 贴壁上的细胞数量不断减少直至消失， 4 d后可以发现贴壁的纺锤细胞数量增加， 并且呈成簇分布， 但是依然含有其他细胞， 但是在经过数次传代培养以后， 混杂细胞逐渐纯化， 细胞初期的以集落增长， 但是在第六代之后均为均匀分布的纺锤形。骨髓基质干细胞的鉴定：经鉴定发现， CD31的阴性率为5.67%， CD34的阴性率为4.31%， CD45的阴性率为4.42%， CD44的阳性率为98.82%， CD71的阳性率为99.17%， CD90的阳性率为98.23%。骨髓基质干细胞体内外标记：将小兔的骨髓基质干细胞免疫组化以后， 结果可以观察到呈棕色的阳性细胞分布， 选择相同的组织片中6个视野不同进行观察， 并将阳性率计算出来， 然后再分别计算不同的标本， 经计算， BrdU标记的细胞所占的比例为87.6%。在运用免疫荧光染色之后发现细胞核染色显著， 但若将BrdU标记骨髓基质干细胞注入体内， 3周以后依然可以看到明显的BrdU着色， 并且在穿刺位置还发现了密集的细胞。
综上所述， CD31、CD34、CD45 的结果为呈阴性， CD44、CD71、 CD90的结果为阳性。BrdU可掺DNA合成期的骨髓基质干细胞， 由此得出贴壁法可获得高纯度的骨髓基质干细胞， BrdU可作为骨髓基质干细胞体内示踪的理想标记物， 依此可以作为检测骨髓基质干细胞的一个依据。
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篇12
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.016
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）02-0060-05
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是紧随肺癌、胃癌、食管癌之后的发病率和死亡率较高的恶性肿瘤。最新数据显示，肝癌在60岁以下的男性中属发病率最高和死亡率最高的癌症[1]。由于肝癌的高复发、高转移率和化疗抗药性，治疗效果并不乐观。近年来，越来越多的学者认为彻底治愈肿瘤的有效疗
法除针对肿瘤组织中的大部分肿瘤细胞，更重要的是靶向其中的肿瘤干细胞[2-3]。肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）是肿瘤组织中存在的极小部分细胞，通常处于静止状态，当受到细胞因子等影响时会导致肿瘤的发生、转移和复发，这均源于CSC拥有很强的自我更新及增殖分化的能力。我们前期以S180荷瘤小鼠、H22荷瘤小鼠为模型进行体内筛选，发现中药石见穿具有较好的抗肿瘤作用[4-5]，进一步对石见穿进行化学成分分析，发现桦木酸（betulinic acid，BA）为石见穿发挥抗肿瘤作用的主要有效成分之一。因此，本实验观察BA对人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖的影响，并从细胞生长周期和细胞凋亡两方面初步探讨其抗肝癌的作用机制。
1 实验材料
1.1 细胞株
人肝癌HepG2细胞株，中国科学院细胞库，目录号TCHu72。
1.2 主要试剂与仪器
BA（Sigma），5-氟尿嘧啶（5-FU，海普药业），胎牛血清（Gibco），DMEM/F12+GlutaMAX-I培B基（Gibco），肝素（Sigma），B27神经细胞生长添加剂（Gibco），碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，Acro Biosystem），成纤维细胞生长因子（EGF，Acro Biosystem），BSA（Sigma），青链霉素混合液（Solarbio），磷酸盐缓冲液（HyClone），0.25%胰蛋白酶、DMSO（MP Biomedicals），无酚红DMEM（Macgene），CCK-8试剂盒（Dojindo），细胞周期试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），FITC Annexin V凋亡试剂盒（BD）。MCO175型CO2培养箱（德国Galaxy公司），TH-200型显微镜（日本Olympus公司），Stnergy-4型酶标仪（美国Biotek公司），IEC-CL31R型离心机（美国Thermo Fisher公司），NAVISO型流式细胞仪（美国Bechman Coulter公司），JCSO344型高压蒸汽灭菌锅（日本Hirayama公司）。
2 实验方法
2.1 人肝癌HepG2肿瘤干细胞培养
参考文献[6-7]进行无血清培养基的制备及人肝癌HepG2肿瘤球干细胞的培养和传代。
2.1.1 无血清干细胞培养基制备 在DMEM/F12培养基中添加20 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF、2% B27、4 μg/mL肝素、0.4%BSA、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。
2.1.2 细胞培养 正常培养人肝癌HepG2细胞，胰酶消化无血清培养基重悬，计数，稀释为2×103/mL，2.5 mL/孔，则5×103/孔接种于低吸附6孔板。置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。1 d后可观察到有悬浮细胞球形成。每3 d半量换液。
2.1.3 细胞传代 当细胞形成悬浮细胞球（约6 d），进行传代培养。将含细胞培养液悬浮细胞收集于离心管中，800 r/min离心5 min，1 mL胰酶替代物TrypLE Express消化，加胰酶时吹打几下稍等片刻，即可加PBS稀释，离心洗涤2～3次后无血清培养基重悬，再取适量加无血清培养基稀释培养。
2.2 分组和给药
正常组：DMEM培养基；对照组：DMEM培养基（含0.01%DMSO）；5-FU组：10 μg/mL 5-FU；BA各剂量组：DMSO为溶剂制备40 mmol/L BA，实验过程中以1000倍培养液稀释为40 μmol/L，同时等比对倍稀释分别得到浓度为20、10、5、2.5、1.25 μmol/L的BA培养液。
2.3 细胞自我更新能力验证
收集肿瘤干细胞，无血清培养基稀释为每毫升500个。在低吸附96孔板上每孔加入150 μL无血清培养基，并将稀释好的肿瘤干细胞2 μL/孔加入96孔板。镜下观察，选取有且仅有1个细胞的孔每日拍照记录。
2.4 细胞增殖检测
将对数生长期的人肝癌HepG2肿瘤干细胞制成1×108/L的细胞悬液，接种于低吸附96孔板，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，24 h后更换不含细胞因子的DMEM/F12培养基同步化使细胞处于G0期，24 h后分组处理，分别培养于BA浓度为40、20、10、5 μmol/L的无血清培养基中，每组设5个复孔，继续培养。48 h后弃上清液，PBS冲洗1遍后每孔加入配制好的CCK-8试剂120 μL，培养箱中继续孵育2 h。将显色完成的液体转移至正常96孔板中，于酶标仪波长490 nm处检测吸光度（OD）值。计算细胞抑制率。细胞抑制率（%）=（对照孔OD值-给药孔OD值）÷对照孔OD值×100%。
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