基因工程载体的种类范文

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[中图分类号]Q789-01 [文献标识码]A [文章编号]1009-5349（2014）11-0081-01

自Edward Jenne医生发明天花疫苗开始，已有几千种疫苗被开发出来，疫苗逐渐成为人类与疾病做斗争的重要武器之一。传统疫苗具有生产的成本高、疫苗中含强毒性致病物质、减毒株突变及部分疾病用传统的疫苗防治收效甚微等缺点。所以，研制更安全、更高效的疫苗十分必要。

DNA重组技术为新一代疫苗――基因工程疫苗的研制提供了全新的方法。基因工程疫苗是指应用DNA重组技术，通过基因组改造，降低病原微生物的致病性，提高免疫原性，进而达到防治传染病的目的。迄今为止，基因工程疫苗是最先进的疫苗，相比传统疫苗而言它有巨大的优势。

一、基因工程疫苗种类

应用基因工程技术开发的已经使用和正在研制的新型疫苗种类主要有基因工程亚单位疫苗、基因工程活载体疫苗、核酸疫苗、合成肽疫苗、转基因植物可食疫苗等。

（一）基因工程亚单位疫苗

该类疫苗仅包含病原体的抗原，不包含病原体的其他遗传信息。基因工程亚单位疫苗通过表达病毒的主要保护性抗原蛋白获得免疫原性，具有安全、便于规模化生产等优点。该类疫苗的制备步骤如下：①了解编码具有免疫原活性的抗原蛋白对应的基因信息。②从大肠埃希氏菌、酵母、转基因动植物等表达系统中选择最适表达载体。如：酵母表达系统已经大规模生产人用重组肝炎疫苗。基因工程亚单位疫苗可细分为：细菌性疾病、病毒性疾病和激素亚单位疫苗。

1.细菌性疾病亚单位疫苗

分离和鉴定致病菌主要免疫原和毒力因子是研究细菌性亚单位疫苗的基础，目前已研制出与炭疽、大肠杆菌病、牛布鲁氏菌病等对应的亚单位疫苗，均能对相应的疾病产生有效的保护作用。史百芬等发现RSVF蛋白亚单位疫苗（PFP-1）注射接种后接种者无呼吸道疾病加剧作用。

2.病毒性疾病亚单位疫苗

大多数病毒基因组已经被克隆和完全测序，因此病毒性亚单位疫苗的研制相对简单。现在病毒性疾病亚单位疫苗主要有口蹄疫、狂犬病、乙肝疫苗等。中国台湾省科学家研制的禽流感亚单位疫苗效力远比灭活疫苗高。祁贤等应用酵母系统表达生产鸡传染性腔上囊病病毒VP2亚单位疫苗，发现其可完全取代传统灭活疫苗。

3.激素亚单位疫苗

该疫苗是以生长抑制素为免疫原的一类疫苗。杜念兴等将大肠埃希氏菌中表达的生长抑制素基因与HbsAg基因融合，通过Vero细胞表达，结果发现表达产物具有良好的免疫原性。杜念兴等用SS基因疫苗免疫小鼠，发现口服型SS基因疫苗免疫小鼠后可在小肠表达HBsAg/SS融合蛋白，推测该基因疫苗刺激机体表达蛋白后能产生SS抗体。

（二）基因工程活载体疫苗

此类疫苗生产主要有两种方法，一是使非致病性微生物表达某种特定病原物的抗原决定簇基因，进而产生免疫原性，另一种是致病性微生物被修饰或去掉毒性基因，但仍保持免疫原性。活载体疫苗结合了活疫苗和死疫苗的共同优点，在免疫力上具有很大的优势，分复制性和基因突变活载体疫苗。

（三）核酸疫苗

核酸疫苗接种后，抗原合成、增加与病原自然感染十分相似;还具有免疫原性单一;易构建和制备，稳定性好，成本低廉，适于规模化生产等优点。

二、展望

疫苗开发具有安全性、有效性、价廉性、易推广性等特点。基因工程疫苗具有传统疫苗无可比拟的优点，是疫苗产品开发的主要方向。研制多联或多价疫苗是基因工程疫苗的主要发展方向。

【参考文献】

[1]李媛，金红，于康震，程浩.基因工程疫苗的研究进展[J].中国预防兽医学报，2000（S1）.

[2]姜健，杨宝灵，李春斌.植物基因工程疫苗研究进展[J].大连民族学院学报，2004（1）.

[3]王恩秀，陈伟华，杜念兴.生长抑素基因工程疫苗对大鼠生长及免疫的影响[J].中国兽医学报，2002（5）.

[4]李轶女，胡英考，沈桂芳.转基因植物基因工程疫苗[J].生物技术通报，2002（2）.

[5]史百芬.对RSV F蛋白亚单位疫苗（PFP-1）接种者的第二年监测：评价抗体持久性和可能的疾病加剧作用[J].国外医学・预防・诊断・治疗用生物制品分册，1995（1）.

[6]刘学东，包振民，王志亮.禽流感病毒H5N1亚型基因工程疫苗设计、表达制备及动物实验研究[J].同济大学学报（医学版），2011（6）.

[7]祁贤，汤奋扬，李亮等.新甲型H1N1（2009）流感病毒的早期分子特征[J].微生物学报，2010（4）.

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一、 基因工程的基础知识

基因工程的理论铺垫――分子生物学发展：

① 艾弗里证明了DNA是遗传物质。

② 沃森和克里克证明了DNA双螺旋结构。

③ 尼仑贝格破译了遗传密码。

二、 酶切

基因工程选择限制性内切酶作为工具，主要是因为它具有比一般酶更高的专一性。由于其具有较高的专一性，因此在基因工程的具体操作中如何选择限制性内切酶是高考的重点考察内容。

1. 限制酶的特异性

例1 判断用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸是否可行？_____。

答案 不可行

解析 限制酶的专一性非常强，其特异性表现在三个方面：识别DNA、识别特定序列（回文）、切割特定位点磷酸二酯键。由于烟草花叶病毒是RNA病毒，所以限制酶不能识别RNA。

另外要特别注意限制酶切割以后的结果，磷酸二酯键断裂，暴露出新的磷酸基团。

2. 限制酶的选择

正确选择限制酶是基因工程中一件非常重要的任务。限制酶的选择应当遵循以下一些原则：不破坏目的基因；不破坏标记基因；目的基因和运载体上都有限制酶的切割位点。当然也要注意用一种限制酶和两种限制酶切割的区别。

例2 与只使用EcoR I相比较，使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止_________

______________________。

答案 质粒和含目的基因的外源DN段自身环化

解析 基因工程中目的基因和质粒可以用同一种酶切，也可以用两种酶切，若用一种酶切，质粒只要切一个切口，目的基因需要切两个切口；若用两种酶切，质粒要切两个切口，目的基因也需要切两个切口。一种酶切出的4个切口都相同，所以有多种连法，两种酶切出的质粒和目的基因上的4个切口两两相同，因此可以防止自身环化。

3. 同尾酶

限制酶种类多样，一些酶之间关系特殊，如例3中的酶I和酶Ⅱ识别不同的序列，但能切出相同的黏性末端，它们切出的末端可以连接，被称为同尾酶。

例3 已知限制酶I的识别序列和切点是―GGATCC―，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是―GATC―。根据下图示判断下列操作正确的是（ ）

A. 质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割

B. 质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割

C. 目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割

D. 目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割

答案 A

三、 连接

1. 连接物类型

经过限制酶切割过以后，暴露出的相同的黏性末端可以自动连接，考生同时需要考虑：酶切以后暴露的所有的黏性末端；目的基因两端的两个黏性末端；目的基因所在DNA上其他片段所含的黏性末端；质粒上的两个黏性末端。综合以上结论，连接产物的类型可能就比较多，如目的基因-目的基因连接物、目的基因-运载体连接物、运载体-运载体连接物、其他DN段-运载体连接物、目的基因自连、运载体自连，若用同一种酶切时后两种连接物不存在。

2. 连接酶

下表简要总结了基因工程中常见酶的特性差异。

例 PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为_____________

___________________。

答案 DNA聚合酶只能将单核苷酸连接到双链DN段的引物链上

解析 如上表所示，DNA聚合酶的合成需要引物，那么连接酶能否催化以上反应呢？也不能，因为连接酶必须将两段DNA相连。RNA聚合酶能否催化以上反应呢？也不能，因为RNA聚合酶虽然不要引物，但其不能催化T参与反应，只能利用U。虽然这些酶都是催化磷酸二酯键，但它们作用的底物差异较大，所以一定要注意辨析。

以上主要介绍了基因工程的三种操作工具，这些内容当然是高考的重点和热点。除此之外有些内容也应当给予一定关注，如：目的基因的获取；目的基因的扩增（PCR）；土壤农杆菌介导的目的基因的导入；重组质粒的筛选；目的基因的检测；转基因生物的安全性；转基因生物的利用等问题。

巩固训练

1. 目前人类利用基因工程的方法成功培育出转基因抗虫棉，以下说法正确的是

（ ）

A. 标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因

B. 抗虫基因导入棉花叶肉细胞后，可通过传粉、受精的方法，使抗虫性状遗传下去

C. 苏云金芽孢杆菌的毒蛋白基因与质粒结合后直接进入棉花的叶肉细胞表达

D. 转基因抗虫棉经过种植，棉铃虫不会产生抗性，这样可以有效消灭棉铃虫

2. 下图四种质粒含有E1和E2两种限制酶的识别，Apr表示抗青霉素的抗性基因，Tcr表示抗四环素的抗性基因。

（1） 将两端用E1切开的Tcr基因与用E1切开的质粒X-1混合连接，连接后获得的质粒类型有______。（可多选）

A. X-1 B. X-2

C. X-3 D. X-4

（2） 若将上图所示X-1、X-2、X-3、X-4四种质粒导入大肠杆菌，然后分别涂布在含有青霉素或四环素的两种培养基上。在这两种培养上均不能生长的大肠杆菌细胞类型有____________、____________。

（3） 如果X-1用E1酶切，产生850对碱基和3 550对碱基两种片段：那么质粒X-2（Tcr基因的长度为1 200对碱基）用E2酶切后的片段长度为______对碱基。

（4） 若将外源的Tcr基因两端用E2切开，再与用E2切开的X-1混合连接，并导入大肠杆菌细胞，结果显示，含X-4的细胞数与含X-1的细胞数之比为13，增大DNA连接酶用量能否提高上述比值？______。原因是________

________________________。

3. 下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点，图l中Cmlr表示氯霉素抗性基因，Ner表示新霉素抗性基因。请回答下列问题：

（1） 将提取的质粒与外源DNA分别加入缓冲液中，选用相应的限制酶处理时，影响处理效果的外界因素主要是______等（写出两点）。

（2） 用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒时，能否使用MspⅠ与BamHⅠ同时切割质粒与外源DNA？答：______，原因是______

___________________________。

（3） 可选用______（两种）限制酶同时酶切质粒与外源DNA，酶切并连接后可获得______种含目的基因的重组质粒，筛选含有该重组质粒的大肠杆菌时，需要在含______的培养基上培养。

（4） 为了从基因文库中分离获取T2噬菌体抗性基因，将重组质粒导入对T2噬菌体敏感的大肠杆菌，然后将含有该大肠杆菌的菌液分别接种在预先涂有______的培养基上培养，从而初步检测目的基因的表达。

答案

1. A 2. （1） ABC

（2） 无质粒细胞 含X-3的细胞

（3） 4 750

（4） 不能 DNA连接酶对DN段没有选择性或者DNA末端相同

3. （1） 温度、pH

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现代生物技术的迅猛发展,成就非凡,推动着科学的进步,促进着经济的发展,改变着人类的生活与思维,影响着人类社会的发展进程。现代生物技术的成果越来越广泛地应用于医药、食品、能源、化工、轻工和环境保护等诸多领域。生物技术是21世纪高新技术革命的核心内容,具有巨大的经济效益及潜在的生产力。专家预测,到2010～2020年,生物技术产业将逐步成为世界经济体系的支柱产业之一。生物技术是以生命科学为基础,利用生物机体、生物系统创造新物种,并与工程原理相结合加工生产生物制品的综合性科学技术。现代生物技术则包括基因工程、蛋白质工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等领域。在我国的食品工业中,生物技术工业化产品占有相当大的比重;近年,酒类和新型发酵产品以及酿造产品的产值占食品工业总产值的17%。现代生物技术在食品发酵领域中有广阔市场和发展前景,本文主要阐述现代生物技术在食品发酵生产中的应用。

一、基因工程技术在食品发酵生产中的应用

基因工程技术是现代生物技术的核心内容,采用类似工程设计的方法,按照人类的特殊需要将具有遗传性的目的基因在离体条件下进行剪切、组合、拼接,再将人工重组的基因通过载体导入受体细胞,进行无性繁殖,并使目的基因在受体细胞中高速表达,产生出人类所需要的产品或组建成新的生物类型。

发酵工业的关键是优良菌株的获取,除选用常用的诱变、杂交和原生质体融合等传统方法外,还可与基因工程结合,进行改造生产菌种。

(一)改良面包酵母菌的性能

面包酵母是最早采用基因工程改造的食品微生物。将优良酶基因转入面包酵母菌中后,其含有的麦芽糖透性酶及麦芽糖的含量比普通面包酵母显著提高,面包加工中产生二氧化碳气体量提高,应用改良后的酵母菌种可生产出膨润松软的面包。

(二)改良酿酒酵母菌的性能

利用基因工程技术培育出新的酿酒酵母菌株,用以改进传统的酿酒工艺,并使之多样化。采用基因工程技术将大麦中的淀粉酶基因转入啤酒酵母中后,即可直接利用淀粉发酵,使生产流程缩短,工序简化,革新啤酒生产工艺。目前,已成功地选育出分解β-葡聚糖和分解糊精的啤酒酵母菌株、嗜杀啤酒酵母菌株,提高生香物质含量的啤酒酵母菌株。

(三)改良乳酸菌发酵剂的性能

乳酸菌是一类能代谢产生乳酸,降低发酵产品pH值的一类微生物。乳酸菌基因表达系统分为组成型表达和受控表达两种类型,其中受控表达系统包括糖诱导系统、Nisin诱导系统、pH诱导系统和噬菌体衍生系统。相对于乳酸乳球菌和嗜热链球菌而言,德氏乳杆菌的基因研究比较缺乏,但是已经发现质粒pN42和PJBL2用于构建德氏乳杆菌的克隆载体。有研究发现乳酸菌基因突变有2种方法:第一种方法涉及(同源或异源的)可独立复制的转座子,第二种方法是依赖于克隆的基因组DN断和染色体上的同源部位的重组整合而获得。通过基因工程得到的乳酸菌发酵剂具有优良的发酵性能,产双乙酰能力、蛋白水解能力、胞外多糖的稳定形成能力、抗杂菌和病原菌的能力较强。

二、细胞工程技术在食品发酵生产中的应用

细胞工程是生物工程主要组成之一,出现于20世纪70年代末至80年代初,是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人们所需物质的技术过程。细胞工程主要有细胞培养、细胞融合及细胞代谢物的生产等。细胞融合是在外力(诱导剂或促融剂)作用下,使两个或两个以上的异源(种、属间)细胞或原生质体相互接触,从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象。细胞融合技术是一种改良微生物发酵菌种的有效方法,主要用于改良微生物菌种特性、提高目的产物的产量、使菌种获得新的性状、合成新产物等。与基因工程技术结合,使对遗传物质进一步修饰提供了多样的可能性。例如日本味之素公司应用细胞融合技术使产生氨基酸的短杆菌杂交,获得比原产量高3倍的赖氨酸产生菌和苏氨酸高产新菌株。酿酒酵母和糖化酵母的种间杂交,分离子后代中个别菌株具有糖化和发酵的双重能力。日本国税厅酿造试验所用该技术获得了优良的高性能谢利酵母来酿制西班牙谢利白葡萄酒获得了成功。目前,微生物细胞融合的对象已扩展到酵母、霉菌、细菌、放线菌等多种微生物的种间以至属间,不断培育出用于各种领域的新菌种。

三、酶工程技术在食品发酵生产中的应用

酶是活细胞产生的具有高效催化功能、高度专一性和高度受控性的一类特殊生物催化剂。酶工程是现代生物技术的一个重要组成部分,酶工程又称酶反应技术,是在一定的生物反应器内,利用生物酶作为催化剂,使某些物质定向转化的工艺技术,包括酶的研制与生产,酶和细胞或细胞器的固定化技术,酶分子的修饰改造,以及生物传感器等。酶工程技术在发酵生产中主要用于两个方面,一是用酶技术处理发酵原料,有利于发酵过程的进行。如啤酒酿制过程,主要原料麦芽的质量欠佳或大麦、大米等辅助原料使用量较大时,会造成淀粉酶、俘一葡聚糖酶、纤维素酶的活力不足,使糖化不充分、蛋白质降解不足,从而减慢发酵速度,影响啤酒的风味和收率。使用微生物淀粉酶、蛋白酶、一葡聚糖酶等制剂,可补充麦芽中酶活力不足的缺陷,提高麦汁的可发酵度和麦汁糖化的组分,缩短糖化时间,减少麦皮中色素、单宁等不良杂质在糖化过程中浸出,从而降低麦汁色泽。二是用酶来处理发酵菌种的代谢产物,缩短发酵过程,促进发酵风味的形成。啤酒中的双乙酰是影响啤酒风味的主要因素,是判断啤酒成熟的主要指标。当啤酒中双乙酰的浓度超过阈值时,就会产生一种不愉快的馊酸味。双乙酰是由酵母繁殖时生成的α-乙酰乳酸和α-乙酰羟基丁酸氧化脱羧而成的,一般在啤酒发酵后期还原双乙酰需要约5～10d的时间。崔进梅等报道,发酵罐中加入α-乙酰乳酸脱羧酶能催化α-乙酰乳酸直接形成羧基丁酮,可缩短发酵周期,减少双乙酰含量。

四、小结

在食品发酵生产中应用生物技术可以提高发酵剂的性能,缩短发酵周期,丰富发酵制品的种类。不仅提高了产品档次和附加值,生产出符合不同消费者需要的保健制品,而且在有利于加速食品加工业的发展。随着生化技术的日益发展,相信会开发出更多物美价廉的发酵制品,使生物加工技术在食品发酵工业中的应用更加广泛。

参考文献

[1]赵志华,岳田利等.现代生物技术在乳品工业中的应用研究[J].生物技术通报.2006,04:78-80.

[2]王春荣,王兴国等.现代生物技术与食品工业[J].山东食品科技.2004,07:31.

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1引言

植物基因工程（plantgeneticengineering）是基因工程原理和技术在植物领域的研究与运用。《植物基因工程》是生命学科相关专业的研究生阶段的重要课程，涉及遗传学、现代分子生物学、生物化学、微生物学及生物信息学等多学科理论知识与实验方法[1]。它利用基因工程理论技术，从供体分离克隆外源基因，在体外与载体DNA重组后，经遗传转化导入受体植物基因组中，并获得有效表达和稳定遗传的转基因植物[2]。《植物基因工程》的教学具有理论性和实践性都很强的特点[3]，一般分为基础知识及实验操作两个部分教学。同时，该课程教学的内容信息量大，部分内容深奥，学生难以理解。近年来，生命科学研究和发展日新月异，即使是经典的《植物基因工程》教材，其中的理论和实验技术方法很容易滞后于当前最新的研究发展状况。而作为一门植物研究领域的专业课，必须在有限的教学时间内尽量提高教学效率。为了让学生在有限的时间内更好地掌握植物基因工程的原理及基本实验操作方法，激发学生研究型思维、提高科研素质。我们近年来对该课程的教学进行了改革探索，并取得一定效果。

2教学内容更新

2.1合理选择教材

我校《植物基因工程》基础理论知识部分选用的教材为王关林等编著的《植物基因工程》（科学出版社，2009），同时参考S.B.Primrose和R.M.Twyman编著的《PrinciplesofGeneManipula-tionandGenomics》（基因操作原理-英文第7版），以及P.C.特纳等编著，刘进元等译的《分子生物学》。所选用的教材系统性和层次性强，涵盖分子生物学、植物基因工程的目的基因的转化、转基因植物的检测、转基因植物的遗传特性及安全性、植物基因工程所涉及的各种现代生物技术等部分。选用的上述辅助教材中，有更为详尽的实验原理、实验操作步骤等介绍，便于我校植物学方向的硕士生根据自己的研究方向和兴趣，更全面地查找阅读实验操作原理，有助于熟悉相关专业的研究前沿，同时逐步习惯阅读英文文献，更为自身选择的研究打下坚实的基础。

2.2教学内容的优化

《植物基因工程》这门课中有很多知识点涉及生命科学的前沿。近年来，生命科学成为发展最快的科学之一[4]，该学科实验方法日新月异，新的载体、酶、菌种不断涌现，实验仪器也愈来愈智能化，经典教材其中所涉及的很多实验方法与目前最新的实验手段常常不吻合。因此，《植物基因工程》的教学过程中必须与时俱进，立足于所选择的教材，及时更新教学内容，才能让学生接触到生命科学前沿研究动态，及时掌握全新实验手段和方法，对这门课产生学习兴趣。由于《植物基因工程》的内容非常宽泛、深奥，许多内容涉及生命科学的前沿，对于缺乏实验基础的研究生而言，过多的宣讲基础知识和原理，不仅乏味，也学生难以理解。而学校安排的课时有限（仅为16课时），上述内容很难在有限的时间内系统介绍，因此，必须对《植物基因工程》教学内容进行大胆的改革探索，才能取得良好的教学效果。首先精简基础知识教学内容：上述选用的教材中，仅仅保留基因工程简介、转基因基本操作原理及植物转基因操作方法及实例这几个部分，其余基础理论知识均结合实验课讲授。由于《植物基因工程》的教学离不开植物组织培养这个环节，因此，对教学内容增加了植物组织培养的基本原理和方法。根据植物基因工程技术日新月异的特点，增加了最前沿的基因工程技术，选用《nature》《plantcell》等世界一流期刊的最新研究论文，介绍如靶向基因修饰新技术——TALEN和CRISPR/Cas9等基因工程最前沿技术原理方法，激发学生的科研的热情。

2.3教学中创设问题

根据《植物基因工程》课程理论与实践紧密联系的特点[5]，在教学的每个环节穿插具有趣味性、启发性及新颖性的知识；根据当前转基因食品成为全社会讨论和关心的热点问题，教学中创设问题，如：“我们身边有哪些转基因植物或食品”，“转基因植物（食品）安全吗”等，要求学生对转基因的每个环节可能引发的生物安全问题展开讨论，激发学生好奇心和求知欲。

3实验教学方法的改革

3.1将部分基础知识和实验操作要领融合教学

《植物基因工程》是一门理论知识和实践紧密结合的课程，培养学生对该课程的兴趣及动手操作能力，是该课程的重要目的之一。而实验课程中所涉及的仪器、试剂、载体、工程菌种类繁多，植物转基因操作要求动手能力强、实验周期长，初次操作容易失败，获得的转基因产物存在假阳性，需要步步检测验证等问题。如何在较短的时间内完成所有实验教学内容，提高教学效果，是实验教学中必须面对的重要问题。《植物基因工程》的实验过程是一个层次化渐进的过程。以实验项目——木本植物桑树的转基因为例，整个实验从植物组织培养开始，涵盖工程菌的选择、培养及鉴定；表达载体的选择、转化、扩增，目的基因克隆、片段回收，转入载体；目的基因与载体的连接、验证及转化农杆菌；含转基因载体的农杆菌侵染事先准备的组织培养的器官或植株，转基因植株的培养和鉴定等多个环节和步骤，实验周期长。由于高等植物自身特点，每操作完一个步骤，往往需要等待较长时间，才能进行下一个实验步骤的操作教学。根据上述特点，我们以实验进展引领理论教学，将植物学的基础知识融入到实验过程中，使多个实验项目层层递进，又有机衔接成为一个整体。这样有利于学生更加高效、直观地掌握基本理论。

3.2鼓励学生动手实践

教师在讲授基础知识结束后，一般随即动手演示，并且讲解每个操作细节的要领。实验室一般尽可能准备实验仪器、器材及试剂，让学生亲自动手实验，使其获得感性认识，增强实验主观能动性，增强对基础知识和基本概念的了解，增强科研热情。

3.3实验教学中充分利用微信工具辅助教学

微信等通信工具已融入现代社会生活中，成为大部分学生日常生活的一部分。利用微信工具辅助实验教学，会带来出其不意的良好效果。每一部分实验均以老师演示，将实验操作细节拍摄成为视频，传到微信群，供学生反复播放揣摩，这样可以提高教学效率，避免大批学生围观教师实验操作，看不清楚其中关键细节；实验中相邻两个步骤之间等待的时间，教师可以将该部分实验所涉及的基础知识总结后上传微信群，并利用微信布置作业，提出问题；可以让少量学生轮流查看如无菌苗生长状态、农杆菌扩增的浓度、目的基因扩增的条带等操作结果，及时拍摄成照片传到微信群，以便于其他学生第一时间知晓实验结果，及时准备下一部分实验；实验中遇到的问题，可以在课外利用微信组织讨论，大大活跃了学习气氛，提高学生学习兴趣，增强了团队协作解决问题的能力。实践证明，利用微信辅助教学的方法，可以彻底改变“灌输式”教学中学生被动接受知识的状况，使每一位学生真正融入实验教学，成为这门课学习的主体。

4结束语

《植物基因工程》的教学方法和思路必须围绕该门课程的特点进行。该门课程涉及生命科学的前沿、同时兼具实验性很强的特点。教师不仅要合理选择教材，同时在教学中，必须合理调整基础知识讲授与实验课的时间比例，以实验教学带动课本教学，将书本基础知识贯穿于整个实验环节。教师自身应该注意以科研促教学，不断提高自身的科研能力和素质，拓宽自身的知识面，及时掌握基因工程最新研究动态，自动掌握和更新实验方法，才能真正掌握这门课的授课艺术，让学生有热情参与到这门课的教学中。和其他任何学科的教学一样，学生始终是《植物基因工程》的学习主体。根据当前学生生活已经离不开手机等特点，利用微信工具辅助实验教学，获得了出其不意的良好效果，激发了学生研究型思维、提高了动手能力及处理解决问题能力，有效培养学生的科研素质。经过两年多的尝试，《植物基因工程》这门课的教学效果获得了极大提高，学生反映这门课再也不枯燥了，在短短16学时的教学中，掌握了基因工程的原理及基本实验操作方法，对转基因的植物有了全新的认识，并且了解到许多生命科学前沿知识，可谓是受益匪浅。许多学生由此对该学科的科研产生了浓厚的兴趣，增强了学习和研究中解决问题的能力。当然，《植物基因工程》这门课的教学是一项系统工程，需要教师在今后教学中继续探索更合理、更科学的教学改革思路，需要教师和学生更多的互动，才能获得更好的教学效果，为社会培养更多具有一定科研素质的人才。

参考文献

[1]王丽,姜寒玉,司怀军.植物基因工程教学的实践体会[J].科教文汇,2012(2):36-37.

[2]王关林,方宏筠.植物基因工程.2版[M].北京:科学出版社,2002.

[3]李晓薇,董园园,李海燕.《植物基因工程》教学实践的几点体会[J].高教学刊,2016(3):116.

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叶绿体作为植物中与光合作用直接相连的重要细胞器,其基因组的功能也因此扮演着十分重要的角色。1882年straburger观察到藻类叶绿体能分裂并进入子代细胞;1909年baur和correns通过在3种枝条颜色不同的紫茉莉间杂交得出,质体是母本遗传的。人们便开始对叶绿体遗传方面产生了浓厚的兴趣[1]。1988年boynton等首次用野生型叶绿体dna转化了单细胞生物衣藻突变体(atpb基因突变体),使其完全恢复光合作用能力,标志着叶绿体基因工程的诞生[2]。叶绿体基因工程作为一种很具有发展前景的植物转基因技术,在植物新陈代谢、抗虫性、抗病性、抗旱性、遗传育种等方面都将有着越来越重要的意义。

1叶绿体基因工程概述

1.1叶绿体简介

叶绿体是植物进行光合作用的重要器官,是一种半自主型的细胞器,能够进行自我复制,含有双链环状dna。叶绿体dna分子一般长120~160kb。叶绿体dna有ira和irb 2个反向重复序列(分别位于a链和b链),两者基因大小完全相同,只是方向相反,它们之间有1个大的单拷贝区(大小约80kb)和1个小的单拷贝区(大小约20kb)。

1.2叶绿体基因组转化优点

叶绿体基因具有分子量小、结构简单、便于遗传的特点,故相对于传统的细胞核遗传更能高效表达目的基因,这是因为叶绿体基因本身拥有巨大的拷贝数[3]。叶绿体基因可实现外源基因的定点整合,避免位置效应和基因沉默;遗传表达具有原核性;安全性好,叶绿体属于母系遗传,后代材料稳定;目的基因产物对植物的影响小。利用叶绿体基因转化的这些优点,可以加快育种速度和效率,节约育种时间。

1.3叶绿体转化的主要过程

叶绿体转化过程通常分4步:一是转化载体携带外源目的基因通过基因枪法或其他转化体系导入叶绿体;二是将外源表达框架整合到叶绿体的基因组里;三是筛选具有转化的叶绿体细胞;四是继代繁殖得到稳定的叶绿体转化植物[4]。

1.4叶绿体转化的主要方法

依据叶绿体转化的主要过程,生物学家相应地研究若干种叶绿体基因转化的方法,其中常用的叶绿体转化方法:一是微弹轰击法。将钨粉包裹构建完整的质粒载体,用基因枪轰击植物的各种组织、器官,然后对重组叶绿体进行连续筛选,不断提高同质化水平,最后获得所需的转基因植株[5]。二是农杆菌t-dna介导的遗传转化法。将外源目的基因、选择标记基因等构建到农杆菌的ti质粒上,然后通过与植物组织或器官共培养,最后把所需外源基因转化到叶绿体并获得表达。三是peg处理法。只需将构建好的质粒(含外源基因、标记基因、同源片断、启动子、终止子等)在一定的peg浓度下与植物原生质体共培养。

2叶绿体基因工程的应用

2.1提高植物光合效率

植物的光合效率非常有限,太阳能的很小一部分可以转化为植物所需要的能量,从而转变为人类需要的产品。植物光合效率取决于rubisco酶的丰富度。rubisco酶一方面可以制造可溶性蛋白,另一方面也可以限制co2合成。人们可以通过2种直接的方法提高光合速率:一是加速酶催化的循环过程;二是提高酶的特性,减少光呼吸浪费的能量[6]。很多科学家正试图通过提高rubisco酶来提高植物的光合效率,而其中拟南芥和水稻的定点整合试验取得了重大突破,证明叶绿体基因工程是生产高光合效率作物植物的最有价值的方法。

2.2合成有机物质

由于叶绿体型转基因植物具有环境安全性好、底物丰富、产物区域化等优点,已被越来越多的人关注,并成为工业化生产特定有机物质的可靠场所。例如,有科学家已发明了用叶绿体基因工程表达聚3-羟基丁酸酯合成相关基因的方法。聚3-羟基丁酸酯及其他类型的聚3-羟基链烷酸酯同属于聚酯类物质,是自然界中多种细菌的碳源及能源储备物。具有生物可降解性,如取代化学合成塑料将能从源头解决塑料废弃物引起的“白色污染”。其通过构建了含phbb、phm、phbc和aada基因表达盒的叶绿体整合及表达载体,通过基因枪轰击法转化烟草。northem点杂交、rt-pcr分析结果表明,叶绿体型转基因植株中目的基因在转录水平的表达明显高于核转化植株中相应基因。

2.3生产疫苗

人类治疗用蛋白质可以在叶绿体中实现表达,表达效率取决于外源基因的整合位点,增强转录和翻译的调控元件以及外源蛋白的稳定性等。人类已经在用叶绿体基因生产疫苗方面开展了卓有成效的工作。例如,范国昌等将甲型肝炎病毒vp3p1区和丙型肝炎病毒c区融合,并导入到衣藻叶绿体基因组中,融合蛋白得到高效表达,且具有双抗原活性。而霍乱病毒蛋白b(ctb)抗原ctb已经在叶绿体中转化成功,预示着转基因植物疫苗的可商业化前景。tregoning等将tetc基因在烟草叶绿体基因组进行表达,为了增加mrna的稳定性及在烟草叶片内表达的可行性,他们将基因进行了密码子优化,分别表达了未经改造的富含at(72.3%at)和人工合成的富含gc(52.5%at)的基因,tetc-at和tetc-gc的表达量分别为总可溶蛋白的25%和10%。

2.4在植物抗性方面的研究

在抗虫性方面,kota和cosa分别于1999年、2001年将btcryzaaz基因转入烟草叶绿体,前者可100%杀死4 000多倍抗性的抗性虫,后者报道bt表达量达46.1%。在抗逆性方面,人们通过编码sod、apx等酶的基因已经转入到烟草、苜蓿、马铃薯、棉花的叶绿体中,提高了植物的耐氧化能力,从而提高了植物对环境胁迫的耐受能力。

2.5叶绿体基因组在系统发育学上的应用

叶绿体在系统发育学上的优点:一是叶绿体基因组是仅次于核基因组的第二大基因组,为比较研究提供了一个较大的数据基础;二是叶绿体dna的核酸置换率适中,在应用上很有价值。然而,用叶绿体dna研究系统发育也存在着明显的不足:一是叶绿体基因组是母性遗传的,因此并不能单靠叶绿体基因组来解释居群间的杂交现象;二是虽然有越来越多的叶绿体dna被用作分子标记来研究类群间的系统发育关系,但只有将这些分子片段提供的信息与其他的分子片段信息、传统的形态及生理特征结合起来获得更多的信息,才能更接近系统发育的本来面目。

2.6叶绿体基因在消除环境忧虑问题上的前景

当今最为普遍的问题就是外源基因从转基因作物到杂草的逃逸,这一逃逸主要是通过花粉的扩散,产生超级杂草或产生和其他作物之间的基因污染,对环境极为不利。叶绿体基因工程产生的基因逃逸现象的风险远远低于核转化作物,因为大多数作物中的质体dna都是母系遗传,这样就可以避免作物和作物、作物和杂草之间的杂交,消除人们对基因污染的忧虑。

3叶绿体基因工程存在的问题

3.1叶绿体基因转化在杂合体上的稳定性问题

由于高等植物的每个细胞中有10~100个叶绿体,每个叶绿体内有10~100个叶绿体基因组拷贝,因此转化的叶绿体和未转化的野生型叶绿体同时存在于转基因植株中,造成这种杂合体在遗传上是不稳定的。在转化外源基因之前,目前可采用降低叶绿体拷贝数、高压筛选和选用致死突变体作为外源基因的受体等方法使转基因植株易于同质化。

3.2植物的种类有待扩展

可能是由于大多数植物的叶绿体基因组序列不清楚,因此无法确定用于载体构建的同源重组片段和外源基因的插入位点。目前,已成功转化的植物种类很少,只有番茄和烟草通过有性生殖使外源基因获得稳定遗传,而番茄却是唯一能有高的外源蛋白积累的可食用果实的植物。

4展望

虽然在叶绿体基因工程领域人们已经取得了一定的进展,但对于改变叶绿体基因工程中所存在的缺点,科学界仍然要有大量的工作需要进行。为此,寻找更多更加合适的方法来改进叶绿体基因工程,使其优点更加明显,必将在未来生物技术领域带来又一场革命,为人类造福。

5参考文献

[1] 刘良式.植物分子遗传学[m].北京:科学出版社,1997.

[2] boynton j e,gillham n w,harris e h,et al.chloroplast transfo-rmation in chlamydo monas with high veloeity mieroprojeetiles[j].science,1988,240(4858):1534-1538.

[3] 李宏韬,赵淑青,赵彦修,等.叶绿体基因工程简介[j].遗传,2003,25(4):495-498.

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中图分类号：G632 文献标识码：B 文章编号：1002-7661（2014）10-207-01

一、教材分析

“DNA重组技术的基本工具”是人教新课标教材选修3专题一“基因工程” 1.1的内容。本节主要介绍了DNA重组技术的三种基本工具及其作用。教材内容较为抽象，为了更好的让学生理解DNA重组技术的三种基本工具，教材提供了较多的教学素材。例如，通过图片的展示，让抽象的语言在直观的插入中找到注释；通过模拟制作活动，让学生在实际动手中形成正确认识；教材还采用了“生物技术资料卡”的形式，对特别名词进行了诠释，扩展学生的知识面。

二、教学策略

采用问题引导、小组讨论的策略，构建了三个学习任务：1）限制性核酸内切酶――“分子手术刀”；2）DNA连接酶――“分子缝合针”；3）基因进入受体细胞的载体――“分子运输车”。通过问题情境引导学生在思索中学习新知识；通过模拟操作使学生对基因工程的认识形象化；通过组内互助，锻炼学生交流与合作的能力；通过质疑点拨及归纳交流引导学生思考，归纳总结。

三、三维目标

1）知识目标：了解基因工程的基本概念；简述DNA重组技术所需的三种基本工具及其作用。

2）能力目标：通过分析文字材料，培养学生归纳总结的能力；通过学生动手操作重组DNA模型，培养学生的动手能力。

3）情感目标：通过小组活动，培养学生合作精神；通过材料分析，使学生认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。

四、教学过程

1、复习引入

回顾：①一百年前，中国人甚至全世界人有种植抗虫棉的吗？②棉花本身有抗虫基因吗？③抗虫基因从哪来？④培育抗虫棉利用的是哪种育种方法？

通过层层递进的设问，可以使学生从理性思维的角度逐渐回忆出“基因工程的概念”。从而使学生回忆起基因工程又叫做DNA重组技术，引向题目。

过渡：大家都知道DNA是非常小的，它的直径只有我们头发丝的十万分之一。俗话说“工欲善其事，必先利其器”，要想把其它生物的抗虫基因转移到棉花细胞内，就必须要有精密的工具。那么这些工具是什么呢？

2、限制性核酸内切酶――“分子手术刀”

学习任务一: 阅读教材“限制性核酸内切酶――‘分子手术刀’”相关内容，小组讨论归纳答案：①什么是限制酶？它的来源是哪？②限制酶与我们学过的DNA 酶相同吗？③限制酶的作用是什么？④限制酶所识别的序列有什么特点？举例说明⑤限制酶切割的是什么键？⑥限制酶切割后的结果是怎样的？举例说明⑦什么是粘性末端？什么是平末端？两者的区别？

以上问题，学生都可以用以前学过的知识以及书上的生物知识回答，如果遇到困难，教师可以给予适当提示与引导，使学生明确限制酶的来源、作用、特点、结果等。教师可以强调一下识别序列的规律：限制酶所识别的序列，都有中心轴线，中心轴线两侧双链DNA上的碱基是反向对称，重复排列的，称回文序列。如图1所示：

自学检测：1.关于限制酶的说法正确的是A．限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基序列B．EcoR1切割的是G-A之间的氢键C．限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD．限制酶只存在于原核生物中质疑点拨：学生组内讨论展示答案后，由组内同学进行自查自纠，如果有学生答不上来的问题，教师进行解答。如果学生没有疑问，教师可以进行反问：如，将来源不同的DN段连接在一起，需要用同一种限制酶来切吗？

3、DNA连接酶――“分子缝合针”

学习任务二：阅读教材“DNA连接酶――‘分子缝合针’”相关内容，小组讨论归纳答案：①什么是DNA连接酶？它与DNA聚合酶相同吗？②DNA连接酶作用的化学键是什么？③DNA连接酶有哪些种类？其来源和特点分别是什么？

自学检测：2.DNA连接酶催化的反应是A．DNA复制时母链与子链之间形成氢键B．粘性末端碱基之间形成氢键C．两个DN段粘性末端之间的缝隙的连接D．A、B、C都不正确

质疑点拨：反问：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？

4、基因进入受体细胞的载体――“分子运输车”

学习任务三：阅读教材“基因进入受体细胞的载体――‘分子运输车’”小组讨论归纳答案：①基因工程的作用是什么？②基因工程载体包括哪些？③什么叫质粒？④质粒作为载体必须满足的条件有哪些？

自学检测：3.下列哪项不是基因工程经常使用的，用来运载目的基因的载体

A.细菌质粒B.噬菌体C.动植物病毒D.细菌核区的DNA

质疑点拨：想一想，具备什么条件才能充当“分子运输车”？

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1.1 作用：切割特定的核苷酸序列

[高考赏析]（2008，全国I）已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指，如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DN段。现在多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DN段种类数是（ ）

A.3 B.4 C.9 D. 12

【答案】C

【解析】：每一种限制性内切酶切割DNA后会留下特征性的粘性末端，同时一次切割后，会把DNA分割成两个片段，且不同的内切酶切后的片段不一样。若在3个酶切点切断，得到4种长度不同的DN段；若在2个酶切点切断，得到3种长度不同的DN段；若在1个酶切点切断，得到2种长度不同的DN段。因此最多能产生4+3+2=9种长度不同的DNA分子。

1.2 作用结果：形成DN段末端

黏性末端：错位切，切下后的两端形成一种回文式的单链末端。

平末端：平切，在两条链的特定序列的相同部位切割，形成一个无黏性末端的平口。

[高考赏析]（2008，江苏）将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。以下是与植物疫苗制备过程相关的图和表。

请根据以下图表回答下列问题。

（1）在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是 。

（2）PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。表1为根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？__________。

（3）图1步骤③所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列是否有专一性要求？ 。

（4）为将外源基因转入马铃薯，图1步骤⑥转基因所用的细菌B通常为 。

（5）对符合设计要求的重组质粒T进行酶切，。假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据图1中标示的酶切位点和表2所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断。

①采用EcoRⅠ和PstⅠ酶切，得到_________种DN断。

②采用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切，得到_________种DN断。

【答案】（1）耐高温 （2）引物对B （3）否 （4）农杆菌 （5）①2 ②1

【解析】：由图1―①过程知，用EcoRI酶和AluI酶切割抗原基因DN段会得到XY片段，由图1―②过程可知，用EcoRI酶和SmaI酶切割质粒产生MN片段。这样形成的两个DN段用DNA连接酶形成重组质粒。其中X、M连接处是EcoRI酶切割位点，M、N之间还有一个PstI酶切割位点。如果用EcoRI酶和PstI酶切割重组质粒，将会在两个切割位点切割产生2种DN段。但若用EcoRI酶切割重组质粒，由于只有一个切割位点，所以只产生一个DN段。

[高考赏析]（2005、天津理综II 31）限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是―GGATCC―，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是―GATC―。在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶Ⅱ的切点。

①请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。

②请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。

③在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接起来？为什么？

【答案】：

①

②

③、可以连接。因为由两种限制性内切酶切割后形成的黏性末端是相同的。

【解析】：基因工程中往往用相同的限制性内切酶切割目的基因和运载体，但不同的限制性内切酶所切割出的黏性末端是相同的，也是可以互补配对的。因此，基因工程中有时也采用不同的限制性内切酶切割目的基因和运载体。

1.3 作用实质：使特定部位的两核苷酸之间的磷酸二酯键断开。

1.4 影响因素：限制酶是一类酶，因此其活性受温度、pH等因素的影响。

[高考赏析]（2007、全国II）下列有关基因工程中限制性内切酶的描述，错误的是（ ）

A、一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列

B、限制性内切酶的活性受温度影响

C、限制性内切酶能识别和切割RNA

D、限制性内切酶可以从原核生物中提取

【答案】：C。

【解析】：由以上分析可知限制性内切酶能识别和切割DNA。

2 限制性内切酶的特异性

限制性内切酶的特异性是指一种限制性内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且在特定的切点上切割。一种酶识别切割部位一般具有反向重复序列，即在切割部位一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。

3 限制性内切酶与其它酶的比较

酶的种类 作用

限制性内切酶（限制酶） 将DNA分子的脱氧核苷酸链的磷酸二酯键切开

DNA聚合酶 按模板有要求将单个脱氧核苷酸连接形成DNA的子链，在DNA复制时起作用

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根据抗原性质可分为灭活疫苗、弱毒活疫苗、亚单位疫苗、工程疫苗、核酸疫苗和转基因植物可饲疫苗；根据疫苗功效则可分为预防性疫苗和治疗性疫苗。

1. 灭活疫苗。将分类离培养的病原微生物（多数为强毒株）用适当的化学试剂将其灭活但保留其免疫原性，与不同的佐剂混合后乳化制成灭活疫苗。目前，用于制备灭活疫苗的佐剂有矿物油佐剂和氢氧化铝佐剂。前者多用于病毒性疫苗，如当前使用的猪圆环病毒灭活疫苗、伪狂犬病毒灭活疫苗；用氢氧化铝作为佐剂制备疫苗静置后，会出现分层，疫苗在使用前摇匀即可，该佐剂多用于细菌疫苗。蜂胶佐剂多用于细菌苗和亚单位疫苗。

灭活疫苗的用途：①新分离的病原，短期内难以致弱。如高致病性猪蓝耳病灭活疫苗、猪圆环病毒灭活疫苗和兔瘟灭活疫苗。②血清型较多的病原，疫苗的保护力呈现血清型特异性，如猪胸膜肺炎放线杆菌（15 个血清型）、副猪嗜血杆菌（15 个血清型）、猪链球菌（35 个血清型）等。③变异频率高的病原，如新分离的口蹄疫Mya-98 株。

猪用灭活疫苗中，有猪伪狂犬病灭活疫苗、猪口蹄疫0 型（单价/ 二价/ 三价）灭活疫苗、猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗、猪圆环病毒灭活疫苗、猪细小病毒灭活疫苗、猪乙脑灭活疫苗、猪链球菌病单价( 二价/ 三价) 灭活疫苗、副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗和猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗等。

灭活疫苗的优点是安全性强，疫苗毒株无毒力返强的危险；多数疫苗的免疫接种效果不受仔猪母源抗体水平高低的干扰；贮存条件方面，一般需冷藏保存，不能冷冻。其缺点是需要免疫次数多，接种后局部反应略大，甚至出现接种部位污染，可引起局部炎症脓肿，影响接种效果，也降低局部的肉品质量。

2．弱毒活疫苗。

疫苗种类指将毒力下降或毒力完全丧失的病原微生物，与牛奶、明胶等佐剂混合后经过低温冻干后形成的疏松状制剂。严格意义上，此类疫苗不包含采用基因工程方法对基因组改变后引起致病性改变的微生物制备的弱毒疫苗。根据所含的疫苗毒株分类不同，可以分为以下几种：（1）细菌活疫苗：如仔猪副伤寒疫苗，猪丹毒- 肺疫活疫苗。（2）病毒活疫苗：猪瘟活疫苗、伪狂犬病活疫苗和猪繁殖与呼吸综合征活疫苗。（3）猪支原体肺炎活疫苗。预防猪寄生虫的活疫苗尚未问世。

我国常用的弱毒活疫苗较多，如猪瘟活疫苗、猪伪狂犬病活疫苗、猪繁殖与呼吸综合征活疫苗、猪乙肝疫苗、猪丹毒活疫苗、猪肺疫活疫苗、仔猪副伤寒疫苗、猪马腺疫链球菌活疫苗等。

活疫苗的优点与缺点：优点是：（1）免疫途径多样：可通过肌肉注射、滴鼻、口服等途径免疫。（2）刺激产生黏膜免疫：除肌肉注射外，滴鼻和口服途径免疫后可刺激机体产生局部分泌型IgA, 形成黏膜免疫，在预防呼吸道感染和消化道感染中具有独特的作用，这是灭活疫苗无法比拟的，如沙门氏菌口服可以刺激机体肠道局部黏膜免疫。（3）免疫后可剌激产生体液免疫和细胞免疫，免疫效果较为确实。（4）免疫次数少于灭活疫苗。（5）接种后局部反应低。缺点：受母源抗体的影响如猪瘟活疫苗、伪狂犬病活疫苗等；受抗菌药物的影响如仔猪副伤寒弱毒疫苗、猪丹毒- 肺疫二联弱毒疫苗和猪支原体弱毒疫苗等；活疫苗运输保存条件严格，需冷冻条件。

3. 基因工程疫苗。

利用分子生物学手段改造病原微生物的基因，获得毒力下降、丧失的突变株或构建以弱毒株为载体、表达外源基因的重组毒（菌）株，并利用它们作为疫苗毒株制备疫苗，包括基因缺失活疫苗和基因工程活载体疫苗。该疫苗与常规弱毒疫苗相比，主要区别在于后者采用常规技术，而非分子生物学技术，来致弱病原微生物，不确定其毒力致弱的分子机制。

作为基因工程疫苗载体的病毒或细菌，其主要特性是：致病力下降或缺失、对靶动物和非靶动物是安全的，基因组庞大、可容纳外源基因，并高效表达。常用的活载体有：伪狂犬病毒弱毒株、腺病毒、沙门氏菌弱毒菌株、乳酸杆菌、胸膜肺炎放线杆菌弱毒株。我国在“十一五”期间，在“863”课题资助下，开展了以伪狂犬病毒为载体，表达猪细小病毒、乙脑病毒、口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒主要免疫原性基因的研究。鉴于对其安全性的忧虑，我国规定转基因生物（包含基因工程 疫苗）必须经历实验室和野外安全性观察测试，获得安全证书后，方能进行疫苗学研宄，以申报兽用生物制品新兽药证书。目前，我国己经批准上市的基因工程疫苗有：猪伪狂犬病基因缺失疫苗、口蹄疫基因工程疫苗、猪大肠杆菌K88-K99 基因工程疫苗。重组载体疫苗尚未正式上市。

4．核酸疫苗。

核酸疫苗产生于20 世纪80 年代。将病原微生物或寄生虫基因组中编码免疫原性蛋白的基因克隆到真核表达载体中制备重组质粒，这种质粒直接导入动物体内，利用宿主体内的转录翻译系统，合成该蛋白，剌激机体产生针对相应的细胞免疫和体液抗体，因而称之为DNA 疫苗。DNA 疫苗可以用大肠杆菌大量制备，成本较低。针对细菌病、病毒病和寄生虫病的DNA 疫苗报道较多。但基于是否整合到宿主染色体等安全性考虑，核酸疫苗多处于实验研宄阶段，尚未大量应用。RNA 疫苗是近几年才出现的一种核酸疫苗，主要在人类医学中，作为RNA 类药物，用于抗肿瘤研宄。在动物疫苗领域尚未见RNA 疫苗的应用报道。

5. 亚单位疫苗与合成肽疫苗。

利用物理化学方法提纯病原微生物中具免疫原性的组份，或者利用基因工程表达该组分，纯化后加入佐剂而制成。猪传染性胸膜肺炎的亚单位疫苗中含有毒素I, 毒素II,毒素III 和外膜蛋白等， 能提供对所有15 个血清型的交叉保护力。我国使用的口蹄疫合成肽疫苗，是利用人工方法合成口蹄疫病毒VP1 蛋白中具有较强免疫原性的抗原片段，加入佐剂制成。该疫苗的优点是抗原组分单一，纯度高，免疫反应强，副作用低；能迅速针对新出现变异毒株研制其合成肽疫苗。但是，其成本较高。

6．转基因植物可饲疫苗。

将病原微生物中编码免疫蛋白的基因插入植物基因组中，获得表达病原微生物免疫原性的植物，再从植物中提纯蛋白用于注射动物或将植物直接饲喂动物，产生免疫力。用于表达免疫原性基因的植物主要是马铃薯、玉米、蔬菜、番茄、烟草和香蕉等，称为转基因可饲疫苗（ediable vaccine)。此类疫苗在口蹄疫（拟南芥、苜蓿和马铃薯为受体)、猪传染性胃肠炎（马铃薯、花椰菜和土豆为受体)、腹泻（烟草为受体）和轮状病毒感染（番茄和马铃薯为受体）等疾病防控中有研究的报道,但未见临床应用。目前的技术难题是：选择直接生食和贮藏方便的植物作为表达植株（烟草不适用于动物基因的筛选和优化其密码子和使用合适启动子，使其表达量满足疫苗免疫剂量的要求；免疫剂量免疫程序的确定；并设法提高口服后黏膜免疫效果。转基因植物可饲疫苗主要应用在胃肠道疾病中。

二、疫苗使用的注意事项

1． 建立在正确的流行病学调查基础上，有针对性选择所需疫苗，不可盲从。对于多血清型菌株感染，应选择与当地流行菌株血清型一致的疫苗，免疫效果要确实。

2．确保疫苗运输和使用过程中的冷链保障。如疫苗的物理性状己经改变，如分层现象，不可用手工混匀后再使用，应丢弃。

3．细菌活疫苗使用前后不可同时使用抗生素或有抗菌活性的中草药。

4．建议使用于健康猪群；正在发病猪群使用紧急接种，可能会加快处于疾病晚期猪只死亡，但是会缩短猪群的病程，因此要有心理准备。

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关键词基因工程;生物柴油;应用;脂类含量;微藻

AbstractBiodiesel，due to its advantages of better burning performance，lower pollution，renewable feature etc.，is the ideal alternative energy source oftraditional fossil fuels and has been widely used in the world.The application of gene engineering in biodiesel production is mainly on improving the lipid content of biodiesel raw materials，such as oil plants and oil microalgae.In this paper，according to the research progress at home and abroad，the application of gene engineering in eight channels to improve the lipid content of biodiesel raw materials were reviewed.At last，it isconcluded that using microalgae as a feedstock is inevitable trend of biodiesel industry’s development in China.With the transcription factor pathway regulating lipid accumulation is an important research direction in the future development of biodiesel industry.

Key wordsgene engineering;biodiesel;application;lipid content;microalgae

社会的发展加速了人类对能源的消耗，能源问题已成为各国亟待解决的世界性问题。统计显示:全球石油探明储量仅供生产40年，这更为人类敲响了能源危机的警钟。此外，化石能源燃烧过程中会产生大量CO2，引起的温室效应将直接影响人类的生存环境。因此，为解决能源和环境问题，世界各国都在积极地寻找新能源，以应对将来可能发生的能源危机。生物柴油作为生物能源的一种，越来越得到各国的重视。与化石柴油相比，生物柴油具有闪点高、燃烧性高、污染小、可再生等优点，是化石燃料的理想替代能源[1]。

生物柴油原料的油脂含量是制约生物柴油发展的一大瓶颈。运用基因工程技术，克隆并特异性表达调控脂类合成相关酶的基因，从而提高生物脂肪酸含量并改变其组分以适应生物柴油发展的需要，是目前解决这一难题的有效手段。本文结合基因工程技术的应用现状，综述了基因工程在改造生物柴油原料中的研究进展，以期对生物柴油产业的发展提供一定指导。

1基因工程概述

基因工程，又称DNA重组技术，是指在基因水平上，以人工的方法取得目的基因，在体外重组于载体上，形成重组DNA分子，然后将重组DNA分子转入受体细胞进行复制、转录和翻译，从而产生人们所需要的目的基因的产物。基因工程技术打破了天然物种屏障，人们可以按照主观愿望，将来自不同生物体的DNA 片段组合到一起，并获得新的表达产物。

基因工程技术促进了生物学的迅猛发展，为解决生命科学领域的一些重大问题提供了强有力的手段，现已广泛应用于农业、医学、食品和环境保护等诸多领域。如培育抗虫、抗病、抗寒、抗旱农作物新品种，生产基因工程药物和可降解有毒物质的工程菌等。同样，在生物柴油的生产中，运用基因工程提高生物柴油原料的油脂含量，也逐步取代了传统方法，并取得了显著的效果。

2基因工程在生物柴油中的应用

生物柴油作为一种新型可再生能源，其生产原料主要为含油植物，如大豆、油菜、棕榈和蓖麻等。此外，将含油微藻作为生物柴油原料，也在逐渐成为一个新的研究领域。用微藻生产生物柴油具有更多优势，缪晓玲等[2]利用小球藻生产的生物柴油，不仅具有传统化石柴油相当的密度、粘度和热值，而且具有更低的冷滤点和良好的发动机低温启动性能。

迄今，基因工程技术在生物柴油中的应用，主要集中在提高含油植物的脂类含量上。虽然在含油微藻方面也有一些研究，但也主要借鉴对含油植物的研究方法。下面结合国内外主要研究方向，综述基因工程在提高生物柴油原料中脂类含量的研究进展。

2.1乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)

乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase，ACCase)是脂肪酸生物合成的关键酶，它催化脂肪酸合成的第一步反应，即催化乙酰辅酶A生成丙二酸单酰辅酶A[3-6]。生物中的ACCase有2种类型:一是异质型，存在于细菌、双子叶植物和非禾本科单子叶植物等的质体中，由BC(生物素羧化酶)、BCCP(生物素羧基载体蛋白)、α型CT(羧基转移酶)和β型CT(羧基转移酶)等4个亚基组成[7-8];二是同质型，存在于动植物、酵母、藻类等的胞质溶胶中，由单亚基组成[9-12]。有研究表明，植物脂肪酸含量与ACCase的活性呈正相关。为了提高含油植物的脂肪酸含量，许多研究者进行了超量表达ACCase的试验。其中，Roesler等将一个叶绿体转移肽和napin启动子与拟南芥同质型ACC1基因融合，然后转化甘蓝型油菜。结果发现，转基因油菜的T1代成熟种子中ACCase的活性增加了1.7~1.9倍，总的含油量约增加了5%。由于ACCase过量表达，也改变了种子脂肪酸的组成[13]。Ohlrogge等[14]用同样的方法转化油菜，获得的转基因油菜T1代成熟种子中ACCase的活性增加了1.7~1.9倍，脂肪酸含量增加了6%。

许多学者研究了ACCase不同亚基在脂肪酸合成中的作用。Alisa等克隆和表达了油棕β-羧基转移酶基因(accD)和生物素羧化酶基因(accC)，研究表明accD基因的表达在维持异质型ACCase的水平及植物种子的含油量中起着最重要的作用。这个研究也首次证明了高水平accD基因的表达，会产生高水平的含油量[15]。此外，Madoka等[16]、Kode等[17]分别采用超量表达和基因敲除技术方法研究了accD基因，结果显示accD基因编码的β-CT亚基是ACCase的限制因子。

对于含油微藻乙酰辅酶A羧化酶的研究比较少，Dunahay等[18]首次报道了含叶绿素微藻的遗传转化。在此试验中，他利用硅藻的遗传转化系统，超量表达ACCase基因(acc1)，初步结果显示，转基因硅藻中ACCase的活性增加了2~3倍。

2.2脂肪酸合成酶(FAS)

脂肪酸合成过程中，乙酰辅酶A经乙酰辅酶A羧化酶催化转变为丙二酰辅酶A后，脂肪酸合成酶(FAS)就以丙二酰辅酶A为底物，继续进行脂肪酸的合成[19]。在植物中，FAS由ACP(酰基载体蛋白)和其他6种酶构成。其中，Dehesh等克隆了编码菠菜酮酰-ACP合酶(KASⅢ)的cDNA基因，使其在烟草、拟南芥和橄榄型油菜中超量表达。结果与正常植株相比，饱和脂肪酸(16∶0)都有所增加，不饱和脂肪酸含量下降[20]。

2.3酰基辅酶A:甘油二酯酰基转移酶(DGAT)

酰基辅酶A:甘油二酯酰基转移酶(acyl CoA:diacylgy-cerol acyltransferase，DGAT)是一种完整的内质网细胞微粒体酶，是催化三酰甘油(triacylgycerol，TAG)合成的最后一步反应的酶，也是甘油三酯合成过程中唯一的关键酶和限速酶。该酶的主要作用机制是使二酰甘油(diacylgycerol，DAG)加上脂肪酸酰基辅酶A形成三酰甘油[21-24]。Jako等首次在野生型拟南芥中，超量表达了种子特异性DGAT的cDNA，结果DGAT的活性增加了10%~70%，种子含油量也有显著增加[25]。Zhang等构建了特异hpRNA(具发夹结构的双链RNA)，用它沉默烟草内源性DGAT1基因，转基因植株的成熟种子含油量下降了9%~49%[26]。

2.4乙酰辅酶A合成酶(ACS)

乙酰辅酶A合成酶不可逆的催化醋酸形成乙酰辅酶A，而乙酰辅酶A可以为脂类的合成提供原料。Roughan等发现乙酰辅酶A合成酶可以将醋酸转化为乙酰辅酶A，并进入脂类合成途径[27]。Lin等在大肠杆菌体内超量表达了其自身乙酰辅酶A合成酶基因(acs)，与对照组相比，乙酰辅酶A合成酶的活性增加了9倍，同时也加速了脂类的生物合成[28]。

2.5ATP-柠檬酸裂解酶(ACL)

ATP-柠檬酸裂解酶催化柠檬酸形成乙酰辅酶A和草酰乙酸，乙酰辅酶A可以为脂类的合成提供原料。Ratledge等研究了ACL的活性与甘蓝型油菜种子脂质积累的关系，发现在种子快速合成脂质过程中，ACL和乙酰辅酶A羧化酶一样，其活性达到最大[29]。Rangasamy等研究了老鼠肝脏ACL基因在烟草质体中的异源超量表达，结果表明超量表达老鼠ACL基因，使烟草质体中总ACL活性增加了4倍，脂肪酸的合成也增加了16%[30]。

2.6苹果酸酶(ME)

苹果酸酶以NADP+为辅酶，催化苹果酸脱氢产生丙酮酸和NADPH，NADPH可用为脂肪酸合成中的还原反应。于是有人提出通过超量表达苹果酸酶，为脂肪酸合成提供充足的还原动力，从而达到提高脂肪酸含量的目的。Wynn等[31]发现苹果酸酶为构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的脂质积累提供主要的还原动力NADPH。随后，Wynn等又进一步研究了NADPH与脂质积累之间的关系。即在丝状真菌中超量表达苹果酸酶，结果有大量NADPH生成，为脂类的合成提供了充足的还原动力，同时也增加了脂质的积累[32]。Zhang等在卷枝毛霉(Mucor circinelloides)中超量表达了苹果酸酶，结果发现苹果酸酶的活性增加了2~3倍，同时脂质的生物合成也增加了2.5倍[33]。

2.7β-氧化途径

脂肪酸的β-氧化途径，是生物体内脂肪酸降解的主要途径，它发生于原核生物的细胞溶胶及真核生物的线粒体基质中。因此，有研究者提出限制脂肪酸β-氧化途径的发生来提高含油植物的脂类含量。其中，Hara等用念珠菌研究了β-氧化途径中的关键酶——酰基辅酶A氧化酶，阻断对该酶所有基因的编码，并希望能增加二羧酸的生成。但结果相反，重组体念珠菌不能利用烷烃，也不能生产二羧酸[34]。由于直接对β-氧化途径关键酶的研究有一定的局限性，Cao等从酯酰辅酶A跨膜转运的角度，对提高念珠菌二羧酸生成进行了研究。在其研究中，通过对肉碱-酯酰转移酶(CAT)基因在重组体中的特异表达，发现当CAT的活性减少1/2时，二羧酸的产率增加了21.0%，对烷烃的转化能力增加了12.0%。但是，如果将CAT基因全部敲除，则重组体不能利用烷烃生产二羧酸[35]。

2.8磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPase)

许多研究者发现油菜蛋白质含量与油脂含量呈负相关，于是有人提出对应的反义技术调控植物油脂含量。陈锦清等[36]提出油脂和蛋白质的“底物竞争”假说，认为葡萄糖酵解产物——丙酮酸是油脂和蛋白质合成的共同底物，2种物质在合成中竞争丙酮酸。乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)和丙酮酸羧化酶(PEPCase)分别是这2种物质合成的关键酶，它们的相对活性就决定了丙酮酸的流向。在这项研究中，他将根癌农杆菌EHA101携带反义PEP基因，然后转化甘蓝型油菜——浙油758和浙优油1号的下胚轴，成功地获得了转基因植株。对浙油758转基因植株的含油量测定显示，种子平均含油量比对照组高6.4%。对浙优油1号转基因植株的油脂及蛋白质含量测定表明，种子平均含油量比对照组高16.7%，其中1株油菜蛋白质含量下降9.7%。对转基因植株及对照组种子的油脂和蛋白质含量进行回归分析表明，2种植株的油脂和蛋白质含量呈显著负相关。张银波等构建了PEP基因的RNAi载体，希望通过抑制蛋白质的合成以使丙酮酸转向油脂的合成。由于RNAi技术的有效性及简易性，若该载体成功实现抑制目的基因，则可以为高油作物的培育开辟新的途径[37]。微藻PEPase的研究借鉴对含油植物的研究方法，其中宋东辉等采用反义PEP技术调控微藻PEPase的代谢途径，初步结果显示，反义抑制PEPase酶活性可以显著提高微藻脂类含量[1]。

3结语

生物柴油具有可再生、污染小、燃烧性高等优点，是一种新型环保可再生能源，具有极广阔的应用前景。目前，世界生物柴油的生产原料主要为含油植物，但根据我国食用油尚需大量进口的情况，不可能将植物油大规模用于生产生物柴油。而且我国土地资源有限，大幅度增加含油植物种植面积难度很大。因此，若要大规模发展我国生物柴油产业，必须寻找其他的生物柴油原料。利用微藻生产生物柴油可以很好地解决上述问题。微藻生长周期短，生长速率快，光合作用效率高，而且不占用农业用地，可以利用微生物发酵技术，在光反应器中高密度培养。因此，将微藻作为生产原料是我国生物柴油产业发展的必然趋势。

目前，国内外运用基因工程技术生产生物柴油还处于初级阶段，多采用单基因的特异表达提高脂类含量水平。但脂类的积累涉及到脂类的生物合成及分解代谢，是一个复杂的系统，不可能通过特异的表达一种基因来大大提高脂类含量。针对以上问题，已有学者提出转录因子途径调控脂类的积累。该途径的主要优势在于，转录因子参与调控代谢途径中的一系列基因。因此，可以通过调控相关转录因子，进而带动代谢途径中的一系列基因超量表达，使脂类水平大大提高。

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篇10

近些年，现代生物技术快速发展的同时，也取得了很大的成就。它既促进社会经济的发展，又推动着科学的进步，并且改变了人们的生活与思维方式，影响着人类的社会文明发展的进程。现代生物技术的成果不断地被广泛应用于食品、医药、化工、轻工、能源和环保等领域；生物技术是以生命科学为基础，利用生物机体和生物系统创造新的物种，通过与工程原理结合加工生产生物制品的综合性的科学技术；现代生物技术主要包括了基因工程、细胞工程、酶工程、蛋白质工程和发酵工程等领域；在我国的食品工业中，生物技术工业化的产品占有很大的比重，最近几年里，酒类和一些新型的发酵产品以及酿造产品的产值占食品工业总产值的17%，现代生物技术在食品发酵领域中有广阔市场和发展前景，本文主要阐述现代生物技术在食品发酵生产中的应用。生物技术是本世纪高新技术革命中的核心内容，生物技术也有着巨大的经济效益和潜在的生产力。专家推测，在今后10年中，生物技术会逐步成为当前世界中经济体系的支柱产业之一。

一、基因工程技术在食品发酵生产中的应用

基因工程是采用类似于工程设计的方案，将具有遗传性目的的基因按照人类的特殊需要，在离体的条件下进行剪切、组合拼接，再将这种人工重组的基因通过载体导入到受体细胞中进行无性繁殖，从而使目的基因在细胞受体中高速转录，生成人类需要的产品或者新的生物类型。它是现代生物技术的核心内容。

优良菌株的获取是发酵工业的关键所在，通常的方法是诱变、杂交以及原生质体融合等，现在可以利用基因工程的技术与之相结合，进行生产菌种的改造，达到高产和高质的效果。下面介绍一下基因工程在食品发酵中应用的几个例子。

1 改良面包酵母菌的性能。最早采用基因工程改造的食品微生物，把优良酶基因转入面包酵母茵中产生的面包酵母菌比普通的面包酵母菌具有更高的麦芽糖透性酶以及更高的麦芽糖含量。在面包生产的过程中，能够产生更多的二氧化碳，从而使得面包膨润松软可口。

2 改良酿酒酵母菌的性能。在酿酒工艺中，同样能够使用基因工程的技术。利用基因工程技术可以培育出新的酿酒酵母菌株，它可以使传统的酿酒工艺得到改进，并且产生多样化。通过基因工程技术的使用，把大麦中的淀粉酶基因导入到啤酒酵母中，便可以直接通过淀粉发酵，这样使得声场流程缩短，工序得到简化，改进了啤酒的生产工艺。目前，已成功地选育出分解糊精和分解β-葡聚糖的嗜杀啤酒酵母菌株、啤酒酵母菌株和促使生香物质含量提高的啤酒酵母菌株。

3 改良乳酸茵发酵剂的性能。乳酸菌在代谢的过程中会产生乳酸，同时降低发酵产品的PH值。它的基因表达系统包括受控表达和组成型表达两种，其中的受控表达系统包括Nisin诱导系统、糖诱导系统、噬菌体衍生系统和PH诱导系统。研究发现乳酸菌的基因突变有两种方法：第一种方法涉及可独立复制（同源或异源的）的转座子，第二种方法是通过克隆的基因片段和染色体上同源部位的重组整合获得。基因工程的使用使得乳酸菌发酵剂具备优良的发酵能力，产双乙酰能力、胞外多糖的稳定形成能力、蛋白水解能力，有较强的抗杂菌和抗病原菌的能力。

二、细胞工程技术在食品发酵生产中的应用

出现于二十世纪七十年代末的细胞工程技术是生物工程技术的主要组成之一，是在细胞的水平上对细胞的遗传特性的进行更改，或者是利用大规模细胞培养，从而摄取人类所需要的物质的一种技术，能够满足人类在生产中对某些稀少细胞的需要，从来达到获取新细胞的目的。

细胞培养、融合以及新城代谢物的形成等是主要的细胞工程技术。其中细胞融合是在诱导剂或者催融剂的作用下，让多个异源细胞或原生质体互相接触，使得这些细胞或原生质体发生隔膜融合、胞质融合以及和融合合并，最终形成杂种细胞的技术。它是一种对微生物发酵菌种改良的最佳途径，能够用来改良微生物菌种的特性，使得目的产物的产量能够提高，合成新的所需产物等。将细胞工程与基因工程相结合在一起，使得对遗传物质进一步的修饰提供了多样的可能性。当前，酵母、霉菌、细菌、放线菌等多种微生物的种间乃至属间，都已成为微生物细胞融合的对象和目标。培育出的新菌种能够应用到更广泛的领域。

篇11

转基因作物的研究规模已达到了空前的水平。自1983年世界上第一例转基因抗病毒植物诞生以来，转基因作物的研制、中间试验、田间释放和商业化种植得到了迅速的发展，到1997年底，转基因植物已达几百种；转基因作物于1986年在美国和法国首次进入大田试验，到1997年底全世界转基因作物的田间试验已达25000多例；1994年，美国批准了转基因延熟番茄的商业化生产，到1997年底，全世界共有51种转基因植物产品被正式投入商品化生产。

转基因作物的种植面积正在迅速扩大。全世界转基因作物的种植面积在1995年仅为1.2×106hm2，1996年为2.84×106hm2，1997年为1.25×107hm2，1998年为2.78×107hm2，1999年增至3.99×107hm2.2000年进一步增至4.42×107hm2，2001年已达5.26×107hm2.2001年全球转基因作物按作物种类统计为：大豆占46%，棉花占20%，油菜占11%，玉米占7%；按国家统计：美国占70%（面积，下同）、阿根廷占22%、加拿大占6%、中国占1%～3％，上述4国占全球转基因作物种植面积的99%；按目标性状分类：抗除草剂转基因作物占77%，抗虫转基因作物占15%.据统计，1999年美国转基因大豆、棉花和玉米的种植面积，分别占该国相应作物种植面积的55%、50%和30%。

转基因作物具有巨大的经济效益，1997年美国转基因抗虫棉种植面积为1×106hm2，平均增产70%，每公顷抗虫棉可增加净收益83美元，直接经济效益近1亿美元；1998年美国种植转基因抗虫玉米达5×106hm2，平均增产9%，其净收益为68.1美元／hm2，可产生直接经济效益3.4亿美元。1995年全球转基因作物的销售额仅为0.75亿美元，1998年达到12亿美元～15亿美元，2000年已达30亿美元，5年间增加了40倍。预计2005年将达60亿美元，2010年将达到200亿美元。

2.植物用转基因微生物

自上世纪80年代以来，重组农业微生物工程研究取得了突破性进展，其中新型重组固氮微生物研究已进入田间试验，一些杀虫、防病遗传工程微生物进入田间试验或商业化生产。防冻害基因工程菌株已于1987年进入田间试验，防治果树根癌病工程菌株也于1991年和1992年先后在澳大利亚和美国获准登记，目前已在澳大利亚、美国、加拿大和西欧一些国家销售，这是世界上首例商品化生产的植病生防基因工程细菌制剂。具有杀虫活性的转B.t基因工程细菌，自1991年起已有多个产品进入市场。在高铵条件下仍保持良好固氮能力的耐铵工程菌株，也进入田间试验。

3.转基因动物

转基因动物主要应用于以下几个方面：改良动物品种和生产性能；生产人药用蛋白和营养保健蛋白；生产人用器官移植的异种供体；建立疾病和药物筛选模型；生产新型生物材料等。1998年全球动物生物技术产品总销售额约为6.2亿美元，预计2010年总销售额将达到110亿美元，其中75亿美元是转基因动物产品。

4. 兽用基因工程生物制品

兽用基因工程生物制品是指利用重组DNA技术生产的兽用免疫制剂。主要包括：单克隆抗体等诊断试剂，目前国内外正在研究、开发或已应用的单克隆抗体诊断试剂已达1000多种；基因工程疫苗，已有44例获准进行商品化生产，其中重组亚单位疫苗30例，基因缺失活疫苗12例，基因重组活疫苗2例。此外，还有DNA疫苗和兽用基因植物源生物制品等。

5. 转基因水生生物

迄今为止，全世界研究的转基因水生生物达20余种，已有8种进入中间试验，其中我国有一种两例，仅有大西洋鲑1种可能已开始小规模商品化生产。

6. 我国农业转基因生物研发现状与产业化概况

我国转基因植物的研究开发始于20世纪80年代，1986年启动的863高新技术计划起到了关键性的导向、带动和辐射作用。据1996年统计，国内正在研究和开发的转基因植物约47种，涉及各类基因103种。1997年～1999年，有26例转基因植物获准进行商业化生产。按转基因性状分：抗虫16例，抗病毒9例，改良品质1例。按作物划分：棉16例，番茄5例，甜椒4例，矮牵牛1例。

转基因抗虫棉是国内植物基因工程应用于农业生产的第一个成功范例，使我国成为继美国之后独立研制成抗虫棉，并具有自主知识产权的第二个国家。1998年～2001年4年累计种植逾1.3×106hm2，减少农药使用量70%以上，产生了巨大的社会、经济和生态效益。由于其伞形辐射的带动作用，抗虫转基因水稻、玉米、杨树等一批后继转基因产品正在进行田间试验，蓄势待发。转基因技术将使农业产业发生深刻的结构变化，向农业与医药、农业与食品、农业与加工结合的方向发展。

我国植物用转基因微生物研究已取得长足进展，正在研发的防病杀虫微生物13种，涉及基因16种；固氮微生物8种，涉及基因12种，大多已进入中间试验和环境释放试验。我国兽用基因工程生物制品研究与产业化进展迅速，已有近70种单克隆抗体等诊断试剂投放市场，2例基因工程疫苗获准进行商品化生产，其中重组亚单位疫苗1例，基因重组活疫苗1例。

篇12

例题一：下列生物中，均由真核细胞组成的一组生物是（ ）

A、小麦、大肠杆菌 B、酵母菌、蝗虫

C、蓝藻、团藻 D、人、流感病毒

解析：流感病毒为非细胞型生物，大肠杆菌和蓝藻为原核生物。小麦、酵母菌、蝗虫、团藻、人是真核细胞构成的真核生物。故答案为B。

知识点二、大肠杆菌的新陈代谢类型为异养厌氧型。

例题二：下列微生物的新陈代谢类型属于异养厌氧型的生物是（ ）

A、根瘤菌 B、圆褐固氮菌 C、大肠杆菌 D、反硝化细菌

解析：根瘤菌、圆褐固氮菌的新陈代谢类型是异养需氧型，大肠杆菌的新陈代谢类型是异养厌氧型，反硝化细菌在缺氧环境中可以将硝酸盐转化为亚硝酸盐并最终转化为氮气，其新陈代谢类型是异养厌氧型。故答案为C 、D。

知识点三、大肠杆菌在生态系统中的地位：在生态系统中能够将动植物的遗体、排出物和残落物中所含的有机物，逐渐分解成无机物，归还到无机环境中，被绿色植物重新利用，所以属于生态系统中的分解者。

例题三：下列微生物中属于分解者的是（ ）

A、根瘤菌 B、蓝藻 C、大肠杆菌 D、硝化细菌

解析：根瘤菌与豆科植物互利共生，是消费者。蓝藻是光能自养型生物，硝化细菌是化能自养型生物，都属于生产者。只有大肠杆菌是分解者。故答案为C.

知识点四、大肠杆菌的细胞结构

大肠杆菌为原核细胞构成，结构比较简单，与真核细胞相比，最主要的特点是没有核膜包围的典型的细胞核。细胞表面有一层坚固的细胞壁，主要成分是由糖类与蛋白质结合而成的化合物，细胞膜的化学组成和结构与真核细胞相似，细胞质内没有高尔基体、线粒体、内质网和叶绿体等复杂的细胞器，有分散的核糖体、质粒，细胞内含有丝状的区域叫做拟核，DNA分子上不含有蛋白质成分，所以没有真核细胞所具有的染色体。特殊结构有荚膜、鞭毛和芽孢。

例题四： 大肠杆菌在生长时，细胞内钾离子的质量分数是培养液的3000倍。如果在培养液中加入不影响细胞呼吸作用的药物，大肠杆菌细胞内钾离子的质量分数立即下降，这种药物的作用是（ ）

A、破坏了线粒体的结构 B、抑制了细胞内呼吸酶的活性

C、破坏了细胞内的遗传物质 D、抑制了细胞膜上载体的活性

解析： 大肠杆菌为原核生物，细胞内无线粒体。钾离子是通过主动运输被吸收的。此药物不影响呼吸作用，则ATP可正常合成，所以只考虑载体的情况。故答案为D。

知识点五、大肠杆菌的遗传物质和基因结构：大肠杆菌为原核细胞构成，其拟核中有一个大型的环状DNA分子，控制着大肠杆菌的主要遗传性状，细胞质中含有质粒，质粒上面含有几个到几百个基因，控制着大肠杆菌的抗药性、固氮、抗生素生成等性状。构成大肠杆菌的基因是由成百上千个核苷酸对组成的，包括能够编码蛋白质的编码区和编码区上游和下游不能编码蛋白质的非编码区，编码区是连续的，不间隔的。

例题五：下列有关大肠杆菌遗传物质的叙述正确的是（ ）

A、大肠杆菌只有拟核中含有遗传物质

B、大肠杆菌的基因中只有外显子，没有内含子

C、大肠杆菌基因结构中的非编码序列是位于编码区上游和下游的核苷酸序列

D、大肠杆菌基因结构中的非编码序列是位于编码区上游和下游的核苷酸序列和编码区中的内含子

解析：大肠杆菌为原核细胞构成，其拟核和质粒中都有基因，原核细胞基因是连续的，不间隔的，无外显子和内含子之分。故答案为C。

知识点六、大肠杆菌在基因工程中的作用：在基因工程中大肠杆菌可作为受体细胞，细胞中的质粒可以作为运输目的基因的运载体。例如：将大肠杆菌的质粒取出，连接上人生长激素基因后，重新置入大肠杆菌的细胞内，然后，用这种带有人生长激素基因的工程菌进行发酵，就能得到大量的人生长激素。

例题六：1979年，科学家将动物体内能够产生胰岛素的基因与大肠杆菌的DNA重组并且在大肠杆菌内表达获得成功。下列有关说法错误的是（ ）

A、胰岛素基因和大肠杆菌的DNA重组时，需要DNA连接酶

B、通常用一种限制性内切酶处理人的胰岛素基因，用另一种酶处理大肠杆菌的质粒DNA

C、检测胰岛素基因是否进入了大肠杆菌，通常根据受体细胞是否具有质粒特有的某种抗性来确定

D、将胰岛素基因导入大肠杆菌后，由于大肠杆菌繁殖的速度非常快，因此在短时间内就能获得大量的胰岛素

解析：基因工程中要用同一种限制性内切酶切取目的基因和运载体，以露出相同的黏性末端，两者的黏性末端黏合时，需要DNA连接酶。作为运载体，大肠杆菌的质粒要具有标记基因。大肠杆菌为原核生物，体积小，繁殖速度快，在发酵工程中被广泛应用。故答案为B。

知识点七、大肠杆菌的鉴定：在微生物培养基中加入伊红和美兰，如果有大肠杆菌，其代谢产物（有机酸）就与

伊红和美兰结合，使菌落呈深紫色，并带有金属光泽。

例题七：如果大肠杆菌和圆褐固氮菌混合，采用下列哪组培养基可将大肠杆菌鉴别，将圆褐固氮菌分离（ ）

A、无氮培养基和牛肉膏蛋白胨培养基 B、加食盐培养基和牛肉膏蛋白胨培养基