基因治疗的基本策略范文

引言：寻求写作上的突破？我们特意为您精选了4篇基因治疗的基本策略范文，希望这些范文能够成为您写作时的参考，帮助您的文章更加丰富和深入。

篇1

目前钙离子通道拮抗剂作为治疗高血压、缓解心绞痛的常用药，以其价格低廉、疗效显著及相对安全，在临床中被广泛应用。其常见的不良反应如：低血压、心动过速、颜面潮红、外周水肿、充血性心衰等，而近年来一些少见不良反应，尤其是该类药物导致牙龈增生的报道相继出现，逐渐引起临床医生的重视[1]。研究发现，在钙离子拮抗剂中，硝苯地平所致牙龈增生最为常见。本文就临床观察到的1例服用硝苯地平后出现牙龈增生的病例进行探讨。

1 资料与方法

1.1一般资料 将我院2015年3月接收1例服用硝苯地平患者出现牙龋增生者作为调查对象，冯某，男，44岁，高血压病10余年，最高血压170/120 mmHg，服用硝苯地平10 mg，1次/ d 3年余，查体：一般情况可，血压110/90 mmHg，心率70次/min，双侧牙龈增生，心肺腹查体阴性，双下肢对称性指凹性水肿。诊断：高血压病3级（极高危）钙离子拮抗剂所致双下肢水肿及牙龈增生，见图1。

图1 牙龈增生

1.2方法 停用硝苯地平，更换降压药为替米沙坦40 mg Qd美托洛尔23.75 mg Qd及短期应用利尿剂。

2 讨论

硝苯地平引起牙龈增生的发病率，国外文献报道为14%～83%，国内有文献报道为20.8%，通常表现为牙龈边缘和牙龈增生，质地坚韧、略有弹性，无痛，一般不出血，但多数患者会伴有牙龈炎症，出现牙龈出血、松软和颜色的改变[2]。

目前，硝苯地平致牙龈增生发病的分子及细胞学机制尚不十分明确，主要与胶原代谢紊乱、激素、炎症与免疫反应等有关，且其发病可能与多种易感因素有关，如遗传因素、个体易感性、用药剂量、疗程、菌斑指数及牙龈炎症、性别、年龄等，其中研究发现，不同人群对硝苯地平的反应不同，发生牙龈增生亦因人而异，即可能分为硝苯地平牙龈敏感型及硝苯地平牙龈耐受型，且用药剂量越大、用药疗程越长，其发生率越高，病变越重。亦有研究发现，口腔卫生条件差、菌斑指数高可加重牙龈炎症，是引起牙龈增生的独立危险因素，一般男性的发病率高于女性，大致为女性的3倍，考虑可能与硝苯地平阻止钙离子内流，使细胞外钙离子堆积，刺激局部雄性激素的代谢，从而促进成纤维细胞的增殖或使胶原酶释放减少有关，另有研究提示其发病率与年龄呈负相关，年龄越小发病率越高，随着年龄增长，其发病率降低[3-6]。

药物性牙龈增生的治疗，首先是停用可能有影响的药物，最好更换为其他类型降压药，大多数患者停药后数月内可自行缓解，对血压控制不好，无法停药的患者，最好采用联合用药，减少单药用药剂量，也能一定程度减少其发病率。对于一些中重度牙龈增生，还可就诊于口腔科，行牙周治疗，如菌斑控制、龈上洁治和龈下刮治、根面平整等，对于严重牙龈增生的患者还可行手术切除，然而该治疗仅为短暂缓解，术后复发率高，尤其是对于未停药、口腔卫生条件差或缺乏口腔护理的患者，因此保持良好的口腔卫生、定期行专业的口腔清洁、控制牙菌斑亦为重要的治疗方案[7-10]。

综上，药物性牙龈增生不仅影响咀嚼功能，同时会影响美观、加重牙龈炎症、产生口腔异味等，也有研究发现牙周疾病的慢性感染过程能够影响心血管系统，最终将形成恶性循环，不利于高血压与冠心病的治疗，故这一问题应该引起临床医生的重视，深入研究其发病机制，寻找更多更有效的治疗方案。

参考文献：

[1]Ilgenli T，Atilla G，Baylas H.Effectiveness of periodontal therapy in patients with drug induced gingival overgrowth.Long―term results[J]. J Periodontol，1999，70：967-972.

[2]Barak S，Engelberg IS，Hiss J.Gingival hyperplasia caused by nifedipine.Histopathologic findings[J]. J Periodontol，1987，58：639-642.

[3]Fattore L，Stablein M，Bredfeldt G，et al.Gingival hyperplasia：a side effect of nifedipine and diltiazem[J]. Spec Care Dent，1991，11：107C109.

[4]徐莉，李伟力.硝苯吡啶与牙龈增生关系的临床研究[J].北京医科大学学报，1997，29（2）：180-182.

5.Eslami M，Baghaii F，Jalayer Nadery N.An Investigation on gingival hyperplasia induced by nifedipine[J]. J Dent（Tehran），2004：1：33-37.

[6]Handajani J1，Santoso AL，Haniastuti T，et al.Effect of nifedipine on the expression of bcl-2 protein in rat gingiva[J]. Clin Oral Investig，2003，7（1）：56-58.

[7]Lu H-K，Chou H-P，Li C-L，et al.Stimulation of Cells Derived from Nifedipine-induced Gingival Overgrowth with Porphyromonas gingivalis Lipopolysaccharide，and Interleukin-1β[J]. J Dent Res，2007，86：1100-1104.

篇2

疾病模型，动物； 小鼠

肝癌的基因治疗，特别是自杀基因治疗，在控制肿瘤的增殖、预防和延缓复发和转移，以及提高病人生活质量方面具有独特的优势，成为肝癌治疗活跃的研究领域［1-3］。从已有的研究结果来看，单纯自杀基因治疗仍难以达到完全根治肿瘤的目的。因此，寻找自杀基因疗法的增效方法是目前各种肿瘤自杀基因治疗的研究热点之一。

免疫机制是旁观者效应产生的重要机制［4-5］，改善自杀基因疗法作用的炎症免疫微环境是自杀基因疗法增效的主要途径［6-7］。六味地黄丸具有增强机体免疫功能和直接抗肿瘤作用［8-13］，我们前期的研究结果显示其对小鼠移植性肝癌HSVtk/GCV自杀基因治疗具有增效作用［14］，本文旨在观察其疗效的病理学机制，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器 细胞培养瓶、培养板、滤膜、冻存管等为美国Corning公司和丹麦NUNC公司产品；Polybrene和G418为Sigma公司产品；DMEM、RPMI1640、胎牛血清为Gibco公司产品；新生牛血清为杭州四季青公司产品。主要仪器为BNA3210型CO2培养箱（日本ESPEC），亿鸣200病理图像分析系统（中国亿鸣）等。

1.2 动物 昆明种小鼠，18～22g，雄性占2/3，雌性占1/3，健康，清洁级，由广州中医药大学实验动物中心提供（合格证号：2003A008）。

1.3 细胞株 病毒包装细胞PT67购自美国Clontech公司，已于前期将重组pLXSNtk质粒转染入PT67细胞内记为PT67/tk［15］；小鼠肝细胞癌细胞株H22购自中山大学实验动物中心细胞库。

1.4 药物及配制 六味地黄丸为北京同仁堂产品（批号：4030098），于无菌室内用消毒研钵加少许消毒蒸馏水研磨后，配成浓度为500g/L的药液，小鼠给药剂量为生药10g·kg-1·d-1；丙氧鸟苷（GCV）为丽珠集团湖北科益药业有限公司产品（批号：040701），于无菌室以注射用生理盐水25mL溶解，浓度为10g/L，小鼠给药剂量为100mg·kg-1·d-1。

1.5 小鼠肝细胞癌细胞株H22的感染及GCV体外杀伤效应的观察 复苏包装细胞PT67/tk，吸取其培养上清液，加入H22的培养液中，上清液病毒感染H22细胞后用G418(800mg/L)筛选，获得抗性细胞克隆，命名为H22/tk，将H22/tk和野生型H22细胞分别以2×103、3×103、5×103个/孔接种96孔板，同时加入不同浓度的GCV使终浓度分别为0.01、0.1、1、10、100mg/L，以不加GCV的细胞孔作对照，每一个浓度设4个复孔，于倒置显微镜下观察杀伤效应。

1.6 造模及治疗

1.6.1 小鼠移植性肝癌的造模 将H22/tk和野生型H22按1：4混合（模拟临床体内病毒感染肿瘤细胞比率10%～20%）。混合后的细胞制备成1×1010个/L的细胞悬液，台盼蓝活细胞计数＞90%；按0.2mL/只（含2×106个肿瘤细胞）细胞悬液接种于小鼠的皮下。

1.6.2 分组及治疗 昆明种小鼠90只，随机分为5组：正常对照组、模型对照组、六味地黄丸治疗组、自杀基因治疗组、联合治疗组（自杀基因联合六味地黄丸），正常对照组10只，其他组各20只。正常对照组右前肢腋下注射生理盐水0.2mL，其他各组右前肢腋下接种肝癌细胞悬液0.2mL。正常对照组和模型对照组第2～16天蒸馏水灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射生理盐水每天0.25mL/只；六味地黄丸治疗组第2～16天六味地黄丸悬液灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射生理盐水每天0.25mL/只；自杀基因治疗组第2～16天蒸馏水灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射GCV每天0.25mL/只；联合治疗组第2～16天六味地黄丸悬液灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射GCV每天0.25mL/只。

1.7 疗效观察及病理学机制

1.7.1 肿瘤质量及抑瘤率 实验结束后处死动物，用眼科剪分离剥取肿瘤，万分之一电子天平称质量，记录结果。计算抑瘤率［16］:p抑瘤/%=（mmodel－mtreatment）/mmodel×100%。

1.7.2 病理学观察及半定量分析 肿瘤用体积分数10%中性甲醛固定，常规石蜡切片，苏木素-伊红（HE）染色，光镜观察肿瘤细胞的密度、肿瘤坏死、间质反应，并采用盲法评分。肿瘤细胞密度：根据肿瘤细胞大小及密集程度分为+、++、+++3个等级。坏死分为+：灶状坏死；++：网状多灶状坏死；+++：大片状坏死。纤维结缔组织根据肿瘤间质内及瘤周纤维的增生情况由低到高依次分为+、++、+++3个等级。肿瘤细胞核分裂像计数方法为每张HE染色切片随机取5个非坏死区域高倍视野，对核分裂像进行计数。

1.7.3 增殖核抗原（PCNA）免疫组化染色及阳性细胞计数 采用免疫组化SP法。切片脱蜡至水，入体积分数1%过氧化氢溶液20min；磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗，5min×3次；滴加封闭液，20min；滴加增殖核抗原抗体，37℃湿盒，60min；PBS漂洗，5min×3次；滴加生物素标记二抗，30min；PBS漂洗，5min×3次；滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，60min；PBS漂洗，5min×4次；联苯二胺(DAB)显色，10min，Mayer苏木素复染5s，干燥后中性树胶封片。胞核呈棕黄色为阳性细胞，每张切片随机取5个非坏死区域高倍视野，计数阳性细胞个数并取平均值。

1.7.4 肿瘤细胞凋亡的检测 采用原位末端标记（TUNEL）法。切片脱蜡至水；蛋白酶K消化10min；PBS漂洗，5min×3次；滴加反应液，37℃湿盒，60min；PBS漂洗，5min×3次；加入体积分数0.3%的过氧化氢，20min；PBS漂洗，5min×3次；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，30min；PBS漂洗，5min×3次；DAB染色10min，Mayer苏木素复染，干燥后中性树胶封片。以胸腺组织为阳性对照，不加末端脱氧核苷酸转移酶作为阴性对照。细胞核呈棕黄色为阳性细胞，每片随机选取5个非坏死区域高倍视野，计数阳性细胞的个数，以同一视野内阳性细胞占总细胞的百分比表示细胞凋亡指数：p凋亡/%=(n阳性细胞/n总细胞）×100%。

1.8 统计学处理 计量资料采用SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析；等级资料采用Ridit分析。

2 结果

2.1 体外杀伤效应 铺板48h后，H22/tk100mg/L浓度孔中细胞开始死亡，表现为胞膜不完整，轮廓模糊，不透亮，形状不规则，并且碎裂成小粒状；10mg/L以下组仅见极少数细胞死亡，且增殖明显。野生型H22细胞均呈现明显的细胞增殖。72h后，H22/tk的GCV100mg/L以上浓度孔中绝大部分细胞碎裂成小粒状，孔内基本无活细胞生存；其他包括野生型H22细胞孔均呈现明显的细胞增殖。表明体外病毒感染肝癌细胞成功，病毒携带的外源性自杀基因已表达且具有生物学活性，可用于体内治疗的实验研究。

2.2 肿瘤质量及抑瘤率 表1结果表明，各治疗组肿瘤质量均较模型对照组轻，其中联合治疗组与模型对照组比较，差异有显著性意义（P＜0.05）。

2.3 病理学观察及半定量分析 各组肿瘤细胞均表现为大小不一，核大深染，形状不规则，肿瘤间质内及瘤周有不同程度的纤维结缔组织增生，肿瘤组织内均可见不同程度的大片坏死。模型对照组与六味地黄丸治疗组均见肿瘤组织内细胞密度较大，自杀基因治疗组与联合治疗组见肿瘤组织内细胞密度较低，仅自杀基因治疗组肿瘤细胞密度与模型对照组比较差异有显著性意义（P＜0.05），见表2，图1。

2.4 肿瘤细胞的增殖与凋亡 六味地黄丸治疗组和联合治疗组核分裂像明显少于肿瘤模型组和自杀基因治疗组，其中联合治疗组核分裂像最少。增殖核抗原阳性细胞着色部位位于细胞核，呈黄褐色，六味地黄丸治疗组与联合治疗组阳性细胞数均少于其他两组，以联合治疗组阳性细胞数最少。各治疗组肿瘤细胞凋亡较模型对照组明显增多，以联合治疗组最明显，见表3，图2-4。表1 各组小鼠肿瘤质量及抑瘤率比较表2 各组病理分析统计结果表3 各组肿瘤细胞增殖与凋亡检测结果

3 讨论

自杀基因是指在一定条件下，可以引起细胞自动死亡的基因。目前常用的自杀基因是通过编码病毒或细菌的酶介导敏感性，而这些酶能把药物的无活性形式转化为毒性代谢产物，从而抑制核酸合成，导致细胞死亡［16］。

HSVtk/GCV为目前研究最深入、最具有应用前景的肿瘤自杀基因治疗系统之一，已广泛应用于各种恶性肿瘤的治疗，并已进入Ⅲ期临床实验。HSVtk基因在肿瘤细胞内表达胸苷激酶，可催化核苷类似物，如丙氧鸟苷（GCV）等形成单磷酸化产物，并在细胞内磷酸激酶作用下形成三磷酸产物，干扰细胞分裂时DNA合成，从而导致细胞死亡［17］。

自杀基因治疗由于存在旁观者效应（bystander effect）的独特机制已成为恶性肿瘤基因治疗的研究热点和最具有应用前景的肿瘤基因治疗方法。所谓旁观者效应是指导入了自杀基因的肿瘤细胞加入前体药物后，不仅自身被杀死，其邻近未导入自杀基因的细胞也被杀死的现象［18］。由于存在旁观者效应，自杀基因疗法对肿瘤细胞的杀伤作用被有效地放大。旁观者效应形成机制的假说主要包括［18］：(1)"缝隙连接"机制；(2)免疫介导机制；(3)"细胞凋亡"机制；（4）介质机制；(5)抗肿瘤血管生成机制，等等。

由于免疫介导机制在体内自杀基因疗法旁观者效应中的重要作用。改善自杀基因抗肿瘤作用的炎症免疫微环境是提高自杀基因疗法疗效的重要策略。现代药理学研究结果表明，滋阴补肾代表复方六味地黄丸（汤）对机体细胞免疫和体液免疫均有明显的增强效应；能明显改善荷瘤机体的免疫状态，并具有一定的直接抗肿瘤作用。我们以六味地黄丸的免疫药理作用与肿瘤自杀基因疗法旁观者效应的免疫介导机制之内在联系为研究的切入点，以实验性肝细胞癌为治疗对象，比较研究了自杀基因疗法联合六味地黄丸治疗与单纯自杀基因治疗或单纯六味地黄丸治疗的抗肿瘤效果。研究结果显示：联合治疗组对肿瘤生长的抑制作用较单纯自杀基因治疗组或单纯六味地黄丸治疗组更为明显［14］。

在进一步的病理学研究中，虽然病理学观察表明自杀基因治疗组与联合治疗组的肿瘤组织内细胞密度较低，各治疗组纤维组织增生均较明显，但通过盲法对肿瘤的病理定量分析研究则显示肿瘤细胞密度、肿瘤坏死、间质反应各组间差异均无统计学意义。造成这种现象的原因最有可能是观察者不能很好地把握分级标准，以及病理半定量分析的不够精确，这有待于通过多次的重复实验及增加样本量或运用更为精确的分析方法（如图像分析等）来解决。 肿瘤的生长速度与肿瘤细胞的增殖与凋亡速度相关。PCNA与细胞核分裂像均为评价细胞增殖能力的重要指标。本实验结果显示：联合治疗组与六味地黄丸治疗组的PCNA阳性细胞数及核分裂像数均少于模型组、自杀基因治疗组，其中联合治疗组与模型组、自杀基因治疗组比较，差异均有显著性意义(P＜0.05)，结果说明六味地黄丸可能具有一定的抑制肿瘤增殖的作用；其他各组间的差异均无统计学意义，而自杀基因治疗组从绝对值看略高于模型对照组，其结果与文献报导自杀基因治疗后残存肿瘤细胞会加速增殖相符。同时，从本实验结果来看，各治疗组肿瘤细胞凋亡均有增多，联合治疗也显示了更明显的诱导肿瘤细胞凋亡的效果。

本研究结果提示：肿瘤细胞增殖抑制和肿瘤细胞凋亡增多都与六味地黄丸对肝癌自杀基因治疗的增效作用有关。其机理可能是在六味地黄丸的参与下，不仅发挥了直接抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的功效，而且通过对机体整体与局部的抗肿瘤免疫的调节或其他机制（如"缝隙连接"机制等），使得自杀基因治疗的旁观者效应在力度上得以增强，在时限上得以延续，从而更好地发挥了自杀基因疗法的抗肿瘤作用。

【参考文献】

［1］王建立，徐克森，寿楠海.肝癌的基因治疗［J］.中国现代普通外科进展，2004，7(3)：133.

［2］孙晓毅，吴在德.肝癌的自杀基因治疗［J］.国外医学·外科学分册，1998 ，25(1)：13.

［3］Ghoumari A M，Rixe O，Yarovoi S V，et al.Gene transfer in hepatocarcinoma cell lines: in vitro optimization of a virusfree system［J］.Gene Ther，1996，3(6)：483.

［4］孙春晓，何荣根.自杀基因治疗与免疫调节研究进展［J］.国外医学·免疫学分册，1999，22(4)：218.

［5］Freeman S M，Ramesh R，Marrogi A J.Immune system in suicidegene therapy［J］.Lancet，1997，349(9044)：2.

［6］Jones R K，Pope I M，Kinsella A R，et al.Combined suicide and granulocytemacrophage colonystimulating factor gene therapy induces complete tumor regression and generates antitumor immunity［J］.Cancer Gene therapy，2000，7(12)：1519.

［7］Pizzato M，Franchin E，Calvi P，et al.Production and characterization of a bicistronic Moloneybased retroviral vector expressing human interleukin 2 and herpes simplex virus thymidine kinase for gene therapy of cancer［J］.Gene Ther，1998，5(7)：1003.

［8］杜标炎.肾阴虚造型及补肾中药对小鼠免疫功能的影响［J］.广州中医学院学报，1995，12(4)：30.

［9］杜标炎，徐勤，罗惠，等.六味地黄汤抗糖皮质激素所致小鼠胸腺萎缩的病理学研究［J］.广州中医药大学学报，1999，16(2)：111.

［10］杜标炎，徐勤，吴绍锋，等.六味地黄汤对糖皮质激素肾阴虚模型免疫器官淋巴细胞凋亡的抑制作用（Ⅰ）［J］.广州中医药大学学报，2000，17(3)：204.

［11］贾泰元.六味地黄方的免疫调节作用［J］.中成药，1994，16(9)：34.

［12］刘福君，茹祥斌.地黄及六味地黄汤（丸）的免疫药理及抗肿瘤作用［J］.中草药，1996，27(2)：116.

［13］宋丽丽，张瑜，张大禄.六味地黄方的免疫、抗肿瘤药理研究［J］.中成药，2001，23(12)：910.

［14］杜标炎，王慧峰，谭宇蕙，等.六味地黄丸对小鼠移植性肝癌自杀基因治疗的增效作用［J］. 广州中医药大学学报，2007，24(2)：132.

［15］孙春晓，何荣根.恶性肿瘤自杀基因治疗研究进展［J］.实用肿瘤杂志，1999，14(4)：255.

篇3

Abstract

AIM: To investigate the killing effects of tumor cells specific vector of suicide gene of CDglyTK driven by hTERT promoter on retinoblastoma Y79 cells in vitro.

METHODS:At first，the recombinant plasmid was transfered into Y79 cells with electroblot as a delivery system. RTPCR and Western blot analysis were used to determine the CDTK mRNA and protein expression in Y79 cells which had been transfected by pcDNA3.1CMV hTERT CDTK plasmid vector. The conversion efficiency of 5FC into 5FU in CDglyTKexpressing Y79 cells was measured by HPLC. The killing effects of double suicide genes on Y79 cells that treated with 5FC，GCV of different concentrations were determined by the method of MTT.

RESULTS:The expression of CDTK gene in Y79 cells was certificated by RTPCR and Western blot and a 59kD protein was obtaind which was equal to the sequence expection of CDTK gene. In MTT analysis，there was significant difference between transfected and nontransfected survival Y79 cells(P

CONCLUSION:The recombinant plasmid vector pcDNA3.1CMV hTERT CDTK can be transcribed and translated into CDTK fusion protein in Y79 cells.The transfer of the CDglyTK fusion gene into Y79 cells followed by the administration of 5FC or GCV can kill Y79 cells in vitro. The killing effect of two predrugs is stronger than that of one predrug.

KEYWORDS: CDglyTK gene; retinoblastoma;suicide gene therapy;5FC; GCV

自杀基因治疗是近年来肿瘤研究的热点领域之一，也是目前最有可能有效应用于临床的肿瘤基因治疗策略之一。构建安全高效的载体是基因治疗的关键。我们已经成功的构建了含有hTERT启动子的肿瘤特异性杀伤载体pcChCDTK[1]。我们将探讨该载体对人视网膜母细胞瘤Y79细胞在体外的作用。

1材料和方法

1.1材料

Y79细胞株[美国模式菌种收集中心(ATCC)];RPMI1640细胞培养基(Gibco);胎牛血清(Gibco);5FC，5FU，GCV(Sigma);Reverse Transcription system kit(Invitrogen);Trizol(Gibco); QIAfilterTM plasmid Maxi kit(Qiagen); Triton X100(CalBiochem); ECL试剂盒(Amersham pharmacia biotech); PVDF膜(Amersham pharmacia biotech);双丙烯酰胺(BioRad); MTT(Sigma);鼠TK mAb(QED公司);兔抗鼠IgG二抗(KPL公司);蛋白质Marker(上海生化试剂公司);实验所用引物 (上海生工生物工程有限公司)：yCDrt：5’ACGCTGTGTTGTCGGTGAGAA3’;TKrt：5’CAC CACCACGCAACTGCTG3’;βactin F：5’CACCCTGAAGTA CCCCATCG3’;βactin R：5’TTGCCAATGGTGATGACCTG3’。

1.2方法

将经过证实的含有pcChCDTK质粒的JM109菌液0.2mL接种到200mL含50mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，280r/min的摇床上培养16h，将菌液转移到离心瓶中。然后按照QIAfilterTMplasmid Maxi kit提供的步骤进行操作提取质粒pcChCDTK，干燥后，加无菌水溶解质粒300μL，用Duc 640分光光度计测定DNA含量，20℃分装保存。用RPMI1640培养液培养Y79细胞，每日在倒置相差显微镜下观察。Y79细胞悬浮生长，培养中细胞可聚集成团并沉集于培养瓶底部，当细胞基本铺满瓶底即可传代，按照1∶2～1∶4传代。将传代后的Y79细胞培养24h后，细胞进入对数生长期，即可用于电转化。未转染Y79细胞生长迅速，传代后培养24h后，细胞进入对数生长期。取上述进入对数生长期并基本铺满瓶底的细胞，在22℃，1000r/min的条件下，离心10min，收集细胞。用0.01mol/L PBS 10mL重悬细胞，取细胞悬液20μL，用细胞计数板计数，其余细胞在22℃，1000r/min条件下，离心10min，重新收集细胞;根据计数结果，用0.01mol/L PBS以6.25×109/L的密度重悬细胞。取800μL细胞重悬液加入到含有pcChCDTK质粒20μg的EP中，吹打混匀，然后转入0.4cm的电击杯中，以2kV，25μF的条件进行电击。电击后，迅速将电击产物分至已加入10mL 200mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液的75cm2培养瓶中，置37℃，50mL/L CO2的细胞培养箱内培养。电转染后的Y79细胞生长与未转染细胞相似。倒置相差显微镜下见细胞悬浮生长，形状饱满，色泽鲜亮，聚集成团。

1.2.1 CDTK基因表达的检测

提取Y79细胞RNA;参照reverse transcription system kit进行RTPCR反应;取逆转录产物2μL作为模板，以yCDrt和TKrt为引物扩增CDTK，同时用βactin扩增引物作对照，RTPCR产物用8g/L琼脂糖凝胶跑胶检测。另取未转染的Y79细胞设为对照，同法处理。取转染48h和未转染的Y79细胞预处理;固定玻片;配制分离胶和堆积胶;上样;跑胶;转膜;封闭;加一抗;洗一抗;加二抗;洗二抗;显色;曝光。

1.2.2 5FU浓度的检测

人视网膜母细胞瘤细胞株Y79用含200mL/L胎牛血清RPMI1640培养液在37℃，50mL/L CO2细胞培养箱中正常培养。细胞在转染肿瘤特异性杀伤载体pcChCDTK前24h换液，调整细胞密度使之在转染时达基本铺满瓶底。将细胞在22℃，1000r/min的条件下，离心10min，收集细胞，用适当体积的无血清的RPMl1640培养液重悬，细胞计数，使之密度为6.25×109/L。取细胞悬液800μL加入自杀基因载体pcChCDTK 20μg，将其混匀，转入0.4cm的电击杯中，以2kV，25μF的条件进行电击。电击后，细胞接种入培养瓶中培养，24h后收集细胞并用1×PBS洗3次，然后用含200mL/L胎牛血清的RPMl1604培养液配成细胞悬液，以每孔2×105个细胞的浓度植入24孔板，每孔培养液体积1mL。24h后加入前体药物5FC(200mg/L)。在加5FC 24h后取其细胞上清，用高效液相色谱仪(HPLC)检测其5FU的浓度。配5FC及5FU标准品的浓度梯度做标准曲线。LC10A高效液相色谱仪;分析柱: Shimpack CLCODS(5μm，150mm×4.6mm，ID);预柱YWGODS(10μm，10mm×4.6mm，ID);流动相：甲醇/水(20/80);流速1mL/min;检测波长266nm;柱温37℃。10μL进样。

1.2.3前体药物对细胞毒性的检测

采用Western Blot技术检测新融合自杀基因CDTK在视网膜母细胞瘤Y79细胞中的蛋白质水平表达。人视网膜母细胞瘤细胞株Y79用含200mL/L胎牛血清RPMI1640培养液在37℃，50mL/L CO2细胞培养箱中正常培养。以2×105个细胞的密度将细胞接种到96孔板中培养，每孔体积200μL。24h后，加入不同浓度的前体药物100μL，即5FC以0，25，50，100，200，400，800mg/L;GCV以0，2，4，8，16，32，64mg/L加入96孔板。每个浓度梯度有4孔。留1孔不加细胞，只加培养液做空白对照孔。在37℃，50mL/L CO2的条件下，细胞不换液培养5d后，每孔加入(5g/L) MTT溶液20μL，37℃，继续孵育4h，终止培养，吸去培养上清液。每孔加入DMSO 150μL，振荡10min，使结晶物充分溶解。比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上调定各孔吸收值。以每天进行换液的细胞做对照，假设细胞存活率为100%，将其它各细胞孔的吸收值与其比较得出各处理组细胞的平均存活率。另视网膜母细胞瘤细胞在转染前24h换液，调整细胞密度使之在转染时达基本铺满培养瓶底。将pcChCDTK载体电转染Y79细胞。电击后，细胞接种入培养瓶中培养，24h后，收集细胞并用0.01mol/L PBS洗3次，然后用含200mL/L胎牛血清的RPMl1604培养液配成细胞悬液，以每孔2×105个的密度植入96孔板中培养，每孔体积200μL。24h后加入不同浓度的前体药物100μL，5FC+GCV以两药的对应浓度加入96孔板，每个浓度梯度有4孔。留一孔不加细胞，只加培养液做空白对照孔。然后用MTT法检测细胞存活率。统计学分析：所得数据用SPSS 11.5统计软件包进行统计，采用StudentNeuman Keuls(SNK)检验，以P

2结果

2.1 Y79细胞转染后CDTK基因的表达

RTPCR检测结果显示，转染组可见一403bp特异条带，与预期大小一致(图1)。而在未转染的对照组细胞中，未扩增出403bp特异条带。在两组中均扩增出作为内对照的βactin产物561bp条带。分析结果显示：大小为42kD的内参βactin蛋白条带在转染和未转染的Y79细胞中均可见，一个大小为59kD的条带，在转染了pcChCDTK载体的Y79细胞中可见，这与yCDTK基因序列分析的预期蛋白大小一致，为自杀基因yCDTK蛋白。未转染pcChCDTK的Y79细胞中则没有59kD的条带出现(图2)。

2.2 Y79细胞转染后5

FC转化效率 加5FC 24h后上清中5FU的浓度平均含量为169mg/L，5FC向5FU的转化效率约为84.5%。

2.3前体药物对Y79细胞的毒性

将生长良好的人视网膜母细胞瘤Y79细胞，按每孔2×105个细胞接种到96孔板中培养。加入不同浓度的前体药物5FC培养5d，平均细胞存活率分别为98.2%，94.7%，90.5%，88.2%，89.4%，86.4%和83.9%。SNK检验表明，各梯度间的细胞存活率存在显著性差异(P

2.4前体药物对用肿瘤杀伤载体转染的人视网膜母细胞瘤细胞的毒性检测

将电转了pcChCDTK的人视网膜母细胞瘤细胞，按相同的密度将细胞接种到96孔板中培养。加入不同浓度的前体药物5FC培养5d，平均细胞存活率分别为94.0%，91.6%，85.1%，80.0%，72.7%，69.9%和62.7%。SNK检验表明，各梯度间的细胞存活率存在显著性差异(P

3讨论

目前，相对于传统的视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)治疗方法而言，RB基因治疗不仅可以弥补光凝固治疗、光动力学治疗、温热治疗、冷冻治疗的应用局限性，而且不会产生诸如化学治疗、放射治疗的副作用，更不会因为眼球摘除所导致的致残性而造成患儿心理障碍影响生图1RTPCR产物凝胶电泳图 M:DL2000 Marker;1:转染组可见预期的CDTK(403bp)目的片段和βactin(561bp);2:未转染组;3:阴性对照。图2Western Blot检测CDTK的表达 A：1，2:βactin(42kD);B：1:转染pcChCDTK的Y79细胞，出现一条约59kD蛋白;2:未转染的Y79细胞。

存质量。因此，RB基因治疗的研究越来越为人们所重视，并且通过不同的治疗策略取得了一系列的研究进展。现阶段对RB基因治疗的研究主要集中在4种不同的基因上，包括自杀基因、抑癌基因、抗血管生成基因以及促凋亡基因。RB发生的分子机制还不是太清楚，而且与RB形成相关的抑癌基因凋亡诱导基因种类繁多，与肿瘤血管形成相关的诱导因子和抑制因子多种多样，且分子机制仍有待于进一步研究。我们选择双自杀基因CDTK作为目的基因，实施RB的自杀基因治疗。首先，自杀基因作为肿瘤基因治疗的候选基因，已经在多种肿瘤开展研究[27]。其表达产物和前体药物相互作用来实现肿瘤基因治疗的机制比较清楚。其次，自杀基因和前体药物相互作用产生的毒性物质能通过不同方式实现对邻近肿瘤细胞的旁杀效应，包括直接分泌到细胞外旁杀，或通过细胞间隙连接旁杀，或通过产生凋亡小体、免疫介导来实现旁杀。同时，目前的研究表明，自杀基因系统治疗RB是安全有效的[8]。我们设计的含有双自杀基因CDTK的载体通过电转染的方式导入了视网膜母细胞瘤细胞株Y79细胞。48h后，提取转染Y79细胞RNA，RTPCR的结果可见一403bp特异条带，与预期大小一致，显示双自杀基因CDTK在细胞中mRNA水平得到了表达。Western blot的结果也同样显示，载体转染的Y79细胞中，59kD的目的基因蛋白有明显的表达。这两个实验结果充分说明，我们构建的双自杀基因CDTK在靶细胞Y79中得到表达。先前的研究显示，被设计得的融合基因yCD/UPRT、大肠杆菌CDglyTK以及yCDglyTK具有最强的催化前体药物向细胞毒物转化的能力。我们通过HPLC检测5FU的浓度，上清中5FU的浓度平均含量为169mg/L，故5FC向5FU的转化效率约为84.5%，说明我们所构建的肿瘤特异性双自杀基因载体具有很强的催化前体药物向细胞毒性物质转化的能力。

双自杀基因疗法是将两种自杀基因整合在一起，通过载体转导进入肿瘤细胞，其在肿瘤细胞内表达的融合基因产物具备两种酶的活性。因此，双自杀基因疗法可以大大提高抑制肿瘤生长的功效，同时使得前体药物的用量减半。大量资料表明双前体药物对肿瘤细胞的杀伤作用要强于单前体药物。但也有资料显示双自杀基因之间可能存在拮抗效应。在体外实验中，单独加5FC的细胞杀伤最强，要高于5FC和GCV都加的组，而单独加GCV的细胞杀伤力最低， CD和TK之间没有协同作用，反而可能会相互干扰各自功能的运行。原因可能有两个方面：(1)可能是融合基因yCDglyTK在同时加5FC和GCV时，CD/5FC和TK/GCV两种系统的功能出现拮抗效应;(2)可能是在yCDglyTK融合基因中，由于某种原因，CD和TK的活性在这个融合基因中得到提高，使CD/5FC和TK/GCV两种系统的抑瘤能力同时或其中一种得到增强。当E.coli CD和HSV1 TK基因同时在一种细胞中表达时，会存在相互干扰作用。这种干扰作用的机制到目前还没搞清楚，但干扰作用可能不是发生在基因的转录期，而是在转录之后，TK介导的5FUMP的磷酸化会产生无毒的5FdUDP和5FdUTP，而不是毒性产物5FUDP和5FUTP，从而减低了CD/5FC的细胞毒性作用;或者CD介导的对GCV，ACV等的脱胺反应减低了TK/GCV系统的细胞毒性。yCD/UPRT基因中UPRT的酶活性与单独的UPRT酶活性大致相等，但是yCD/UPRT基因中的CD酶活性要高于单独CD酶活性100倍。这种酶活性的改变可能与这3种酶的蛋白质特性不同有关。加入不同浓度的前体药物5FC，GCV或5FC+GCV于电转了pcChCDTK的人视网膜母细胞瘤Y79细胞培养5d， SNK检验表明，与未转染的细胞对应浓度组比较，当5FC浓度达到100mg/L后各对应浓度平均细胞存活率组间均存在差异(PGCV >5FC。在本实验中，单前体药物对双自杀基因CDTK载体转染的Y79细胞均有杀伤作用，但双前体药物的杀伤作用要强于单前体药物。分析产生这种结果的原因，我们认为：(1)双自杀基因载体具有很强的催化前体药物向细胞毒物转化的能力;(2)这可能与我们加入的CMV增强子能大大促进hTERT启动子启动下游目的基因的表达有关，因为CMV增强子具有强大的增强转录能力，且没有组织特异性。

参考文献

1张永红，唐罗生，雷少波. hTERT启动的双自杀基因CDTK载体的构建.国际眼科杂志2009;9(10):18761880

2陈海金，黄宗海，苏国强，等.慢病毒介导的双自杀基因对大肠癌细胞的靶向杀伤作用.世界华人消化杂志2006;14(17)：16811687

3陈海金，苏国强，黄宗海，等.慢病毒介导的双自杀基因对乳腺癌细胞的杀伤作用.广东医学2006;27(7)：965967

4谭万龙，谢毅，吴元东，等.腺病毒介导融合双自杀基因治疗膀胱癌.南方医科大学学报2006;26(5)：594597

5陈祖兵，梁力建.腺病毒载体介导的双自杀基因对人胆管癌细胞QBC939的体外杀伤实验.中华肝胆外科杂志2006;12(4)：257259

篇4

2生物技术在动物病菌检测中的应用

2.1基因检测动物体内的病菌基因检测技术是利用基因标记的方法，通过基因芯片对被测者细胞中的DNA分子进行比对，分析被检测者是否含标记基因的一种技术。它可以在活体动物的分泌液中检测病毒的存在。如果禽类死亡后，仅仅从表型性状难以判断其是否患有禽流感，而基因检测就是一个重要的判断手段。采集活禽的咽喉分泌液或粪便、死禽的肌肉或组织脏器作为样本，采用RT-PCR基因检测技术判断样本中是否存在禽流感病毒，为病情的判断提供可靠的证据[7]。2.2生物传感器用于细菌性疫病的检测近年来，生物传感器的研究和它在工程技术领域的应用倍受关注，它主要是将生物活性材料（酶、蛋白质、DNA、抗体、抗原、生物膜等）与物理化学换能装置有机结合，利用生物活性物质的高度选择性，来检测生化物质和细菌性疫病。Bourette等将抗E.coli抗体固定在有孔氨丙基玻璃珠上，构造了流动注射免疫传感器，对E.coli进行检测，时间短且灵敏度高[8]。美国Rochester大学医学中心的研究人员从细菌中提取了一种蛋白质作为感觉系统制成硅片探针，如果靶细菌存在就会与探针样本结合，通过相机拍摄探针，便能俘获靶细菌的相关信息，从而进行分析[9]。Kim等建立了沙门氏菌压电免疫生物传感器，通过抗体包被的顺磁小球的磁力加强作用可以检测到鼠伤寒沙门氏菌，而且整个检测过程能在1h内完成[9]。

3生物技术在动物疾病诊断中的应用

3.1对细菌病的诊断猪链球菌是一种重要的共患病的病原菌，对养猪业和人都有严重危害。用传统的病原体分离技术结合血清学试验，能够对猪链球菌进行诊断和血清分型，但该方法工作量大，费时费力且敏感性不高，易产生非特异性结果。拜廷阳等[10]建立了SS9水解探针（TaqMan）模式的荧光实时定量PCR检测方法，与常规PCR方法相比，诊断更加迅速，整个反应可在1～2h内完成，且不需要电泳，其检测灵敏度是常规PCR方法的100倍，并能实现对样品的实时定量检测。3.2对病毒病的诊断动脉炎病毒是引起母猪繁殖障碍和仔猪呼吸症状的一种重要病毒，其突变株可引起高致病性猪蓝耳病，给养猪业造成了巨大的经济损失。刘圆圆等[11]根据该类病毒在Nsp2基因1594～1680处缺失87个碱基的特点，设计了一对特异性引物，利用TaqMan探针，成功建立荧光定量PCR检测方法。该方法不仅特异性强、灵敏度高、能很好地区分高致病性猪繁殖与呼吸系统综合症病毒和其他病毒，而且没有发现假阳性和假阴性现象。

4生物技术在动物疾病治疗中的应用

基因治疗技术可将正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入靶细胞，以纠正基因缺陷或者发挥治疗作用[12]。1990年，第1例基因治疗的成功使得利用基因工程治疗疾病成为现实。目前，基因治疗越来越多地受到科学界的关注。4.1基因治疗药物研制重组腺病毒-p53抗癌注射液是我国和世界上第一个基因治疗药物。它的研制成功开创了基因治疗药物研究的先河，这种广谱的肿瘤基因治疗类新药能够杀灭癌细胞，可与放疗、化疗、热疗协同作用，具有抑制肿瘤血管形成、激活患者免疫功能的作用[13]。4.2动物疾病治疗基因治疗在动物疾病治疗中应用于多个方面。临床上主要用于治疗血液方面的疾病，其基本策略是把一些与血管生成有关的因子如血管生成素-1（Ang1）和人肝细胞生长因子（HGF）等通过合适的传递系统转移到靶细胞，使其在靶细胞内有效表达，从而达到治疗因相关因子缺乏而引起的疾病的目的。此外，还可以治疗某些炎症和内科疾病[14]。目前，基因治疗的有效性已在体外及动物实验中得到证实，部分临床试验亦取得了令人鼓舞的结果。基因治疗作为一种新的治疗手段，已从理论走向实践，但还有许多问题有待解决。