基因治疗的基本策略范文
时间：2023-07-27 09:29:20
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篇1
目前钙离子通道拮抗剂作为治疗高血压、缓解心绞痛的常用药，以其价格低廉、疗效显著及相对安全，在临床中被广泛应用。其常见的不良反应如：低血压、心动过速、颜面潮红、外周水肿、充血性心衰等，而近年来一些少见不良反应，尤其是该类药物导致牙龈增生的报道相继出现，逐渐引起临床医生的重视[1]。研究发现，在钙离子拮抗剂中，硝苯地平所致牙龈增生最为常见。本文就临床观察到的1例服用硝苯地平后出现牙龈增生的病例进行探讨。
1 资料与方法
1.1一般资料 将我院2015年3月接收1例服用硝苯地平患者出现牙龋增生者作为调查对象，冯某，男，44岁，高血压病10余年，最高血压170/120 mmHg，服用硝苯地平10 mg，1次/ d 3年余，查体：一般情况可，血压110/90 mmHg，心率70次/min，双侧牙龈增生，心肺腹查体阴性，双下肢对称性指凹性水肿。诊断：高血压病3级（极高危）钙离子拮抗剂所致双下肢水肿及牙龈增生，见图1。
图1 牙龈增生
1.2方法 停用硝苯地平，更换降压药为替米沙坦40 mg Qd美托洛尔23.75 mg Qd及短期应用利尿剂。
2 讨论
硝苯地平引起牙龈增生的发病率，国外文献报道为14%～83%，国内有文献报道为20.8%，通常表现为牙龈边缘和牙龈增生，质地坚韧、略有弹性，无痛，一般不出血，但多数患者会伴有牙龈炎症，出现牙龈出血、松软和颜色的改变[2]。
目前，硝苯地平致牙龈增生发病的分子及细胞学机制尚不十分明确，主要与胶原代谢紊乱、激素、炎症与免疫反应等有关，且其发病可能与多种易感因素有关，如遗传因素、个体易感性、用药剂量、疗程、菌斑指数及牙龈炎症、性别、年龄等，其中研究发现，不同人群对硝苯地平的反应不同，发生牙龈增生亦因人而异，即可能分为硝苯地平牙龈敏感型及硝苯地平牙龈耐受型，且用药剂量越大、用药疗程越长，其发生率越高，病变越重。亦有研究发现，口腔卫生条件差、菌斑指数高可加重牙龈炎症，是引起牙龈增生的独立危险因素，一般男性的发病率高于女性，大致为女性的3倍，考虑可能与硝苯地平阻止钙离子内流，使细胞外钙离子堆积，刺激局部雄性激素的代谢，从而促进成纤维细胞的增殖或使胶原酶释放减少有关，另有研究提示其发病率与年龄呈负相关，年龄越小发病率越高，随着年龄增长，其发病率降低[3-6]。
药物性牙龈增生的治疗，首先是停用可能有影响的药物，最好更换为其他类型降压药，大多数患者停药后数月内可自行缓解，对血压控制不好，无法停药的患者，最好采用联合用药，减少单药用药剂量，也能一定程度减少其发病率。对于一些中重度牙龈增生，还可就诊于口腔科，行牙周治疗，如菌斑控制、龈上洁治和龈下刮治、根面平整等，对于严重牙龈增生的患者还可行手术切除，然而该治疗仅为短暂缓解，术后复发率高，尤其是对于未停药、口腔卫生条件差或缺乏口腔护理的患者，因此保持良好的口腔卫生、定期行专业的口腔清洁、控制牙菌斑亦为重要的治疗方案[7-10]。
综上，药物性牙龈增生不仅影响咀嚼功能，同时会影响美观、加重牙龈炎症、产生口腔异味等，也有研究发现牙周疾病的慢性感染过程能够影响心血管系统，最终将形成恶性循环，不利于高血压与冠心病的治疗，故这一问题应该引起临床医生的重视，深入研究其发病机制，寻找更多更有效的治疗方案。
参考文献：
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篇2
疾病模型，动物； 小鼠
肝癌的基因治疗，特别是自杀基因治疗，在控制肿瘤的增殖、预防和延缓复发和转移，以及提高病人生活质量方面具有独特的优势，成为肝癌治疗活跃的研究领域［1-3］。从已有的研究结果来看，单纯自杀基因治疗仍难以达到完全根治肿瘤的目的。因此，寻找自杀基因疗法的增效方法是目前各种肿瘤自杀基因治疗的研究热点之一。
免疫机制是旁观者效应产生的重要机制［4-5］，改善自杀基因疗法作用的炎症免疫微环境是自杀基因疗法增效的主要途径［6-7］。六味地黄丸具有增强机体免疫功能和直接抗肿瘤作用［8-13］，我们前期的研究结果显示其对小鼠移植性肝癌HSVtk/GCV自杀基因治疗具有增效作用［14］，本文旨在观察其疗效的病理学机制，现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要试剂与仪器 细胞培养瓶、培养板、滤膜、冻存管等为美国Corning公司和丹麦NUNC公司产品；Polybrene和G418为Sigma公司产品；DMEM、RPMI1640、胎牛血清为Gibco公司产品；新生牛血清为杭州四季青公司产品。主要仪器为BNA3210型CO2培养箱（日本ESPEC），亿鸣200病理图像分析系统（中国亿鸣）等。
1.2 动物 昆明种小鼠，18～22g，雄性占2/3，雌性占1/3，健康，清洁级，由广州中医药大学实验动物中心提供（合格证号：2003A008）。
1.3 细胞株 病毒包装细胞PT67购自美国Clontech公司，已于前期将重组pLXSNtk质粒转染入PT67细胞内记为PT67/tk［15］；小鼠肝细胞癌细胞株H22购自中山大学实验动物中心细胞库。
1.4 药物及配制 六味地黄丸为北京同仁堂产品（批号：4030098），于无菌室内用消毒研钵加少许消毒蒸馏水研磨后，配成浓度为500g/L的药液，小鼠给药剂量为生药10g·kg-1·d-1；丙氧鸟苷（GCV）为丽珠集团湖北科益药业有限公司产品（批号：040701），于无菌室以注射用生理盐水25mL溶解，浓度为10g/L，小鼠给药剂量为100mg·kg-1·d-1。
1.5 小鼠肝细胞癌细胞株H22的感染及GCV体外杀伤效应的观察 复苏包装细胞PT67/tk，吸取其培养上清液，加入H22的培养液中，上清液病毒感染H22细胞后用G418(800mg/L)筛选，获得抗性细胞克隆，命名为H22/tk，将H22/tk和野生型H22细胞分别以2×103、3×103、5×103个/孔接种96孔板，同时加入不同浓度的GCV使终浓度分别为0.01、0.1、1、10、100mg/L，以不加GCV的细胞孔作对照，每一个浓度设4个复孔，于倒置显微镜下观察杀伤效应。
1.6 造模及治疗
1.6.1 小鼠移植性肝癌的造模 将H22/tk和野生型H22按1：4混合（模拟临床体内病毒感染肿瘤细胞比率10%～20%）。混合后的细胞制备成1×1010个/L的细胞悬液，台盼蓝活细胞计数＞90%；按0.2mL/只（含2×106个肿瘤细胞）细胞悬液接种于小鼠的皮下。
1.6.2 分组及治疗 昆明种小鼠90只，随机分为5组：正常对照组、模型对照组、六味地黄丸治疗组、自杀基因治疗组、联合治疗组（自杀基因联合六味地黄丸），正常对照组10只，其他组各20只。正常对照组右前肢腋下注射生理盐水0.2mL，其他各组右前肢腋下接种肝癌细胞悬液0.2mL。正常对照组和模型对照组第2～16天蒸馏水灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射生理盐水每天0.25mL/只；六味地黄丸治疗组第2～16天六味地黄丸悬液灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射生理盐水每天0.25mL/只；自杀基因治疗组第2～16天蒸馏水灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射GCV每天0.25mL/只；联合治疗组第2～16天六味地黄丸悬液灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射GCV每天0.25mL/只。
1.7 疗效观察及病理学机制
1.7.1 肿瘤质量及抑瘤率 实验结束后处死动物，用眼科剪分离剥取肿瘤，万分之一电子天平称质量，记录结果。计算抑瘤率［16］:p抑瘤/%=（mmodel－mtreatment）/mmodel×100%。
1.7.2 病理学观察及半定量分析 肿瘤用体积分数10%中性甲醛固定，常规石蜡切片，苏木素-伊红（HE）染色，光镜观察肿瘤细胞的密度、肿瘤坏死、间质反应，并采用盲法评分。肿瘤细胞密度：根据肿瘤细胞大小及密集程度分为+、++、+++3个等级。坏死分为+：灶状坏死；++：网状多灶状坏死；+++：大片状坏死。纤维结缔组织根据肿瘤间质内及瘤周纤维的增生情况由低到高依次分为+、++、+++3个等级。肿瘤细胞核分裂像计数方法为每张HE染色切片随机取5个非坏死区域高倍视野，对核分裂像进行计数。
1.7.3 增殖核抗原（PCNA）免疫组化染色及阳性细胞计数 采用免疫组化SP法。切片脱蜡至水，入体积分数1%过氧化氢溶液20min；磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗，5min×3次；滴加封闭液，20min；滴加增殖核抗原抗体，37℃湿盒，60min；PBS漂洗，5min×3次；滴加生物素标记二抗，30min；PBS漂洗，5min×3次；滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，60min；PBS漂洗，5min×4次；联苯二胺(DAB)显色，10min，Mayer苏木素复染5s，干燥后中性树胶封片。胞核呈棕黄色为阳性细胞，每张切片随机取5个非坏死区域高倍视野，计数阳性细胞个数并取平均值。
1.7.4 肿瘤细胞凋亡的检测 采用原位末端标记（TUNEL）法。切片脱蜡至水；蛋白酶K消化10min；PBS漂洗，5min×3次；滴加反应液，37℃湿盒，60min；PBS漂洗，5min×3次；加入体积分数0.3%的过氧化氢，20min；PBS漂洗，5min×3次；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，30min；PBS漂洗，5min×3次；DAB染色10min，Mayer苏木素复染，干燥后中性树胶封片。以胸腺组织为阳性对照，不加末端脱氧核苷酸转移酶作为阴性对照。细胞核呈棕黄色为阳性细胞，每片随机选取5个非坏死区域高倍视野，计数阳性细胞的个数，以同一视野内阳性细胞占总细胞的百分比表示细胞凋亡指数：p凋亡/%=(n阳性细胞/n总细胞）×100%。
1.8 统计学处理 计量资料采用SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析；等级资料采用Ridit分析。
2 结果
2.1 体外杀伤效应 铺板48h后，H22/tk100mg/L浓度孔中细胞开始死亡，表现为胞膜不完整，轮廓模糊，不透亮，形状不规则，并且碎裂成小粒状；10mg/L以下组仅见极少数细胞死亡，且增殖明显。野生型H22细胞均呈现明显的细胞增殖。72h后，H22/tk的GCV100mg/L以上浓度孔中绝大部分细胞碎裂成小粒状，孔内基本无活细胞生存；其他包括野生型H22细胞孔均呈现明显的细胞增殖。表明体外病毒感染肝癌细胞成功，病毒携带的外源性自杀基因已表达且具有生物学活性，可用于体内治疗的实验研究。
2.2 肿瘤质量及抑瘤率 表1结果表明，各治疗组肿瘤质量均较模型对照组轻，其中联合治疗组与模型对照组比较，差异有显著性意义（P＜0.05）。
2.3 病理学观察及半定量分析 各组肿瘤细胞均表现为大小不一，核大深染，形状不规则，肿瘤间质内及瘤周有不同程度的纤维结缔组织增生，肿瘤组织内均可见不同程度的大片坏死。模型对照组与六味地黄丸治疗组均见肿瘤组织内细胞密度较大，自杀基因治疗组与联合治疗组见肿瘤组织内细胞密度较低，仅自杀基因治疗组肿瘤细胞密度与模型对照组比较差异有显著性意义（P＜0.05），见表2，图1。
2.4 肿瘤细胞的增殖与凋亡 六味地黄丸治疗组和联合治疗组核分裂像明显少于肿瘤模型组和自杀基因治疗组，其中联合治疗组核分裂像最少。增殖核抗原阳性细胞着色部位位于细胞核，呈黄褐色，六味地黄丸治疗组与联合治疗组阳性细胞数均少于其他两组，以联合治疗组阳性细胞数最少。各治疗组肿瘤细胞凋亡较模型对照组明显增多，以联合治疗组最明显，见表3，图2-4。表1 各组小鼠肿瘤质量及抑瘤率比较表2 各组病理分析统计结果表3 各组肿瘤细胞增殖与凋亡检测结果
3 讨论
自杀基因是指在一定条件下，可以引起细胞自动死亡的基因。目前常用的自杀基因是通过编码病毒或细菌的酶介导敏感性，而这些酶能把药物的无活性形式转化为毒性代谢产物，从而抑制核酸合成，导致细胞死亡［16］。
HSVtk/GCV为目前研究最深入、最具有应用前景的肿瘤自杀基因治疗系统之一，已广泛应用于各种恶性肿瘤的治疗，并已进入Ⅲ期临床实验。HSVtk基因在肿瘤细胞内表达胸苷激酶，可催化核苷类似物，如丙氧鸟苷（GCV）等形成单磷酸化产物，并在细胞内磷酸激酶作用下形成三磷酸产物，干扰细胞分裂时DNA合成，从而导致细胞死亡［17］。
自杀基因治疗由于存在旁观者效应（bystander effect）的独特机制已成为恶性肿瘤基因治疗的研究热点和最具有应用前景的肿瘤基因治疗方法。所谓旁观者效应是指导入了自杀基因的肿瘤细胞加入前体药物后，不仅自身被杀死，其邻近未导入自杀基因的细胞也被杀死的现象［18］。由于存在旁观者效应，自杀基因疗法对肿瘤细胞的杀伤作用被有效地放大。旁观者效应形成机制的假说主要包括［18］：(1)"缝隙连接"机制；(2)免疫介导机制；(3)"细胞凋亡"机制；（4）介质机制；(5)抗肿瘤血管生成机制，等等。
由于免疫介导机制在体内自杀基因疗法旁观者效应中的重要作用。改善自杀基因抗肿瘤作用的炎症免疫微环境是提高自杀基因疗法疗效的重要策略。现代药理学研究结果表明，滋阴补肾代表复方六味地黄丸（汤）对机体细胞免疫和体液免疫均有明显的增强效应；能明显改善荷瘤机体的免疫状态，并具有一定的直接抗肿瘤作用。我们以六味地黄丸的免疫药理作用与肿瘤自杀基因疗法旁观者效应的免疫介导机制之内在联系为研究的切入点，以实验性肝细胞癌为治疗对象，比较研究了自杀基因疗法联合六味地黄丸治疗与单纯自杀基因治疗或单纯六味地黄丸治疗的抗肿瘤效果。研究结果显示：联合治疗组对肿瘤生长的抑制作用较单纯自杀基因治疗组或单纯六味地黄丸治疗组更为明显［14］。
在进一步的病理学研究中，虽然病理学观察表明自杀基因治疗组与联合治疗组的肿瘤组织内细胞密度较低，各治疗组纤维组织增生均较明显，但通过盲法对肿瘤的病理定量分析研究则显示肿瘤细胞密度、肿瘤坏死、间质反应各组间差异均无统计学意义。造成这种现象的原因最有可能是观察者不能很好地把握分级标准，以及病理半定量分析的不够精确，这有待于通过多次的重复实验及增加样本量或运用更为精确的分析方法（如图像分析等）来解决。 肿瘤的生长速度与肿瘤细胞的增殖与凋亡速度相关。PCNA与细胞核分裂像均为评价细胞增殖能力的重要指标。本实验结果显示：联合治疗组与六味地黄丸治疗组的PCNA阳性细胞数及核分裂像数均少于模型组、自杀基因治疗组，其中联合治疗组与模型组、自杀基因治疗组比较，差异均有显著性意义(P＜0.05)，结果说明六味地黄丸可能具有一定的抑制肿瘤增殖的作用；其他各组间的差异均无统计学意义，而自杀基因治疗组从绝对值看略高于模型对照组，其结果与文献报导自杀基因治疗后残存肿瘤细胞会加速增殖相符。同时，从本实验结果来看，各治疗组肿瘤细胞凋亡均有增多，联合治疗也显示了更明显的诱导肿瘤细胞凋亡的效果。
本研究结果提示：肿瘤细胞增殖抑制和肿瘤细胞凋亡增多都与六味地黄丸对肝癌自杀基因治疗的增效作用有关。其机理可能是在六味地黄丸的参与下，不仅发挥了直接抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的功效，而且通过对机体整体与局部的抗肿瘤免疫的调节或其他机制（如"缝隙连接"机制等），使得自杀基因治疗的旁观者效应在力度上得以增强，在时限上得以延续，从而更好地发挥了自杀基因疗法的抗肿瘤作用。
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篇3
Abstract
AIM: To investigate the killing effects of tumor cells specific vector of suicide gene of CDglyTK driven by hTERT promoter on retinoblastoma Y79 cells in vitro.
METHODS:At first，the recombinant plasmid was transfered into Y79 cells with electroblot as a delivery system. RTPCR and Western blot analysis were used to determine the CDTK mRNA and protein expression in Y79 cells which had been transfected by pcDNA3.1CMV hTERT CDTK plasmid vector. The conversion efficiency of 5FC into 5FU in CDglyTKexpressing Y79 cells was measured by HPLC. The killing effects of double suicide genes on Y79 cells that treated with 5FC，GCV of different concentrations were determined by the method of MTT.
RESULTS:The expression of CDTK gene in Y79 cells was certificated by RTPCR and Western blot and a 59kD protein was obtaind which was equal to the sequence expection of CDTK gene. In MTT analysis，there was significant difference between transfected and nontransfected survival Y79 cells(P
CONCLUSION:The recombinant plasmid vector pcDNA3.1CMV hTERT CDTK can be transcribed and translated into CDTK fusion protein in Y79 cells.The transfer of the CDglyTK fusion gene into Y79 cells followed by the administration of 5FC or GCV can kill Y79 cells in vitro. The killing effect of two predrugs is stronger than that of one predrug.
KEYWORDS: CDglyTK gene; retinoblastoma;suicide gene therapy;5FC; GCV
自杀基因治疗是近年来肿瘤研究的热点领域之一，也是目前最有可能有效应用于临床的肿瘤基因治疗策略之一。构建安全高效的载体是基因治疗的关键。我们已经成功的构建了含有hTERT启动子的肿瘤特异性杀伤载体pcChCDTK[1]。我们将探讨该载体对人视网膜母细胞瘤Y79细胞在体外的作用。
1材料和方法
1.1材料
Y79细胞株[美国模式菌种收集中心(ATCC)];RPMI1640细胞培养基(Gibco);胎牛血清(Gibco);5FC，5FU，GCV(Sigma);Reverse Transcription system kit(Invitrogen);Trizol(Gibco); QIAfilterTM plasmid Maxi kit(Qiagen); Triton X100(CalBiochem); ECL试剂盒(Amersham pharmacia biotech); PVDF膜(Amersham pharmacia biotech);双丙烯酰胺(BioRad); MTT(Sigma);鼠TK mAb(QED公司);兔抗鼠IgG二抗(KPL公司);蛋白质Marker(上海生化试剂公司);实验所用引物 (上海生工生物工程有限公司)：yCDrt：5’ACGCTGTGTTGTCGGTGAGAA3’;TKrt：5’CAC CACCACGCAACTGCTG3’;βactin F：5’CACCCTGAAGTA CCCCATCG3’;βactin R：5’TTGCCAATGGTGATGACCTG3’。
1.2方法
将经过证实的含有pcChCDTK质粒的JM109菌液0.2mL接种到200mL含50mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，280r/min的摇床上培养16h，将菌液转移到离心瓶中。然后按照QIAfilterTMplasmid Maxi kit提供的步骤进行操作提取质粒pcChCDTK，干燥后，加无菌水溶解质粒300μL，用Duc 640分光光度计测定DNA含量，20℃分装保存。用RPMI1640培养液培养Y79细胞，每日在倒置相差显微镜下观察。Y79细胞悬浮生长，培养中细胞可聚集成团并沉集于培养瓶底部，当细胞基本铺满瓶底即可传代，按照1∶2～1∶4传代。将传代后的Y79细胞培养24h后，细胞进入对数生长期，即可用于电转化。未转染Y79细胞生长迅速，传代后培养24h后，细胞进入对数生长期。取上述进入对数生长期并基本铺满瓶底的细胞，在22℃，1000r/min的条件下，离心10min，收集细胞。用0.01mol/L PBS 10mL重悬细胞，取细胞悬液20μL，用细胞计数板计数，其余细胞在22℃，1000r/min条件下，离心10min，重新收集细胞;根据计数结果，用0.01mol/L PBS以6.25×109/L的密度重悬细胞。取800μL细胞重悬液加入到含有pcChCDTK质粒20μg的EP中，吹打混匀，然后转入0.4cm的电击杯中，以2kV，25μF的条件进行电击。电击后，迅速将电击产物分至已加入10mL 200mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液的75cm2培养瓶中，置37℃，50mL/L CO2的细胞培养箱内培养。电转染后的Y79细胞生长与未转染细胞相似。倒置相差显微镜下见细胞悬浮生长，形状饱满，色泽鲜亮，聚集成团。
1.2.1 CDTK基因表达的检测
提取Y79细胞RNA;参照reverse transcription system kit进行RTPCR反应;取逆转录产物2μL作为模板，以yCDrt和TKrt为引物扩增CDTK，同时用βactin扩增引物作对照，RTPCR产物用8g/L琼脂糖凝胶跑胶检测。另取未转染的Y79细胞设为对照，同法处理。取转染48h和未转染的Y79细胞预处理;固定玻片;配制分离胶和堆积胶;上样;跑胶;转膜;封闭;加一抗;洗一抗;加二抗;洗二抗;显色;曝光。
1.2.2 5FU浓度的检测
人视网膜母细胞瘤细胞株Y79用含200mL/L胎牛血清RPMI1640培养液在37℃，50mL/L CO2细胞培养箱中正常培养。细胞在转染肿瘤特异性杀伤载体pcChCDTK前24h换液，调整细胞密度使之在转染时达基本铺满瓶底。将细胞在22℃，1000r/min的条件下，离心10min，收集细胞，用适当体积的无血清的RPMl1640培养液重悬，细胞计数，使之密度为6.25×109/L。取细胞悬液800μL加入自杀基因载体pcChCDTK 20μg，将其混匀，转入0.4cm的电击杯中，以2kV，25μF的条件进行电击。电击后，细胞接种入培养瓶中培养，24h后收集细胞并用1×PBS洗3次，然后用含200mL/L胎牛血清的RPMl1604培养液配成细胞悬液，以每孔2×105个细胞的浓度植入24孔板，每孔培养液体积1mL。24h后加入前体药物5FC(200mg/L)。在加5FC 24h后取其细胞上清，用高效液相色谱仪(HPLC)检测其5FU的浓度。配5FC及5FU标准品的浓度梯度做标准曲线。LC10A高效液相色谱仪;分析柱: Shimpack CLCODS(5μm，150mm×4.6mm，ID);预柱YWGODS(10μm，10mm×4.6mm，ID);流动相：甲醇/水(20/80);流速1mL/min;检测波长266nm;柱温37℃。10μL进样。
1.2.3前体药物对细胞毒性的检测
采用Western Blot技术检测新融合自杀基因CDTK在视网膜母细胞瘤Y79细胞中的蛋白质水平表达。人视网膜母细胞瘤细胞株Y79用含200mL/L胎牛血清RPMI1640培养液在37℃，50mL/L CO2细胞培养箱中正常培养。以2×105个细胞的密度将细胞接种到96孔板中培养，每孔体积200μL。24h后，加入不同浓度的前体药物100μL，即5FC以0，25，50，100，200，400，800mg/L;GCV以0，2，4，8，16，32，64mg/L加入96孔板。每个浓度梯度有4孔。留1孔不加细胞，只加培养液做空白对照孔。在37℃，50mL/L CO2的条件下，细胞不换液培养5d后，每孔加入(5g/L) MTT溶液20μL，37℃，继续孵育4h，终止培养，吸去培养上清液。每孔加入DMSO 150μL，振荡10min，使结晶物充分溶解。比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上调定各孔吸收值。以每天进行换液的细胞做对照，假设细胞存活率为100%，将其它各细胞孔的吸收值与其比较得出各处理组细胞的平均存活率。另视网膜母细胞瘤细胞在转染前24h换液，调整细胞密度使之在转染时达基本铺满培养瓶底。将pcChCDTK载体电转染Y79细胞。电击后，细胞接种入培养瓶中培养，24h后，收集细胞并用0.01mol/L PBS洗3次，然后用含200mL/L胎牛血清的RPMl1604培养液配成细胞悬液，以每孔2×105个的密度植入96孔板中培养，每孔体积200μL。24h后加入不同浓度的前体药物100μL，5FC+GCV以两药的对应浓度加入96孔板，每个浓度梯度有4孔。留一孔不加细胞，只加培养液做空白对照孔。然后用MTT法检测细胞存活率。统计学分析：所得数据用SPSS 11.5统计软件包进行统计，采用StudentNeuman Keuls(SNK)检验，以P
2结果
2.1 Y79细胞转染后CDTK基因的表达
RTPCR检测结果显示，转染组可见一403bp特异条带，与预期大小一致(图1)。而在未转染的对照组细胞中，未扩增出403bp特异条带。在两组中均扩增出作为内对照的βactin产物561bp条带。分析结果显示：大小为42kD的内参βactin蛋白条带在转染和未转染的Y79细胞中均可见，一个大小为59kD的条带，在转染了pcChCDTK载体的Y79细胞中可见，这与yCDTK基因序列分析的预期蛋白大小一致，为自杀基因yCDTK蛋白。未转染pcChCDTK的Y79细胞中则没有59kD的条带出现(图2)。
2.2 Y79细胞转染后5
FC转化效率 加5FC 24h后上清中5FU的浓度平均含量为169mg/L，5FC向5FU的转化效率约为84.5%。
2.3前体药物对Y79细胞的毒性
将生长良好的人视网膜母细胞瘤Y79细胞，按每孔2×105个细胞接种到96孔板中培养。加入不同浓度的前体药物5FC培养5d，平均细胞存活率分别为98.2%，94.7%，90.5%，88.2%，89.4%，86.4%和83.9%。SNK检验表明，各梯度间的细胞存活率存在显著性差异(P
2.4前体药物对用肿瘤杀伤载体转染的人视网膜母细胞瘤细胞的毒性检测
将电转了pcChCDTK的人视网膜母细胞瘤细胞，按相同的密度将细胞接种到96孔板中培养。加入不同浓度的前体药物5FC培养5d，平均细胞存活率分别为94.0%，91.6%，85.1%，80.0%，72.7%，69.9%和62.7%。SNK检验表明，各梯度间的细胞存活率存在显著性差异(P
3讨论
目前，相对于传统的视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)治疗方法而言，RB基因治疗不仅可以弥补光凝固治疗、光动力学治疗、温热治疗、冷冻治疗的应用局限性，而且不会产生诸如化学治疗、放射治疗的副作用，更不会因为眼球摘除所导致的致残性而造成患儿心理障碍影响生图1RTPCR产物凝胶电泳图 M:DL2000 Marker;1:转染组可见预期的CDTK(403bp)目的片段和βactin(561bp);2:未转染组;3:阴性对照。图2Western Blot检测CDTK的表达 A：1，2:βactin(42kD);B：1:转染pcChCDTK的Y79细胞，出现一条约59kD蛋白;2:未转染的Y79细胞。
存质量。因此，RB基因治疗的研究越来越为人们所重视，并且通过不同的治疗策略取得了一系列的研究进展。现阶段对RB基因治疗的研究主要集中在4种不同的基因上，包括自杀基因、抑癌基因、抗血管生成基因以及促凋亡基因。RB发生的分子机制还不是太清楚，而且与RB形成相关的抑癌基因凋亡诱导基因种类繁多，与肿瘤血管形成相关的诱导因子和抑制因子多种多样，且分子机制仍有待于进一步研究。我们选择双自杀基因CDTK作为目的基因，实施RB的自杀基因治疗。首先，自杀基因作为肿瘤基因治疗的候选基因，已经在多种肿瘤开展研究[27]。其表达产物和前体药物相互作用来实现肿瘤基因治疗的机制比较清楚。其次，自杀基因和前体药物相互作用产生的毒性物质能通过不同方式实现对邻近肿瘤细胞的旁杀效应，包括直接分泌到细胞外旁杀，或通过细胞间隙连接旁杀，或通过产生凋亡小体、免疫介导来实现旁杀。同时，目前的研究表明，自杀基因系统治疗RB是安全有效的[8]。我们设计的含有双自杀基因CDTK的载体通过电转染的方式导入了视网膜母细胞瘤细胞株Y79细胞。48h后，提取转染Y79细胞RNA，RTPCR的结果可见一403bp特异条带，与预期大小一致，显示双自杀基因CDTK在细胞中mRNA水平得到了表达。Western blot的结果也同样显示，载体转染的Y79细胞中，59kD的目的基因蛋白有明显的表达。这两个实验结果充分说明，我们构建的双自杀基因CDTK在靶细胞Y79中得到表达。先前的研究显示，被设计得的融合基因yCD/UPRT、大肠杆菌CDglyTK以及yCDglyTK具有最强的催化前体药物向细胞毒物转化的能力。我们通过HPLC检测5FU的浓度，上清中5FU的浓度平均含量为169mg/L，故5FC向5FU的转化效率约为84.5%，说明我们所构建的肿瘤特异性双自杀基因载体具有很强的催化前体药物向细胞毒性物质转化的能力。
双自杀基因疗法是将两种自杀基因整合在一起，通过载体转导进入肿瘤细胞，其在肿瘤细胞内表达的融合基因产物具备两种酶的活性。因此，双自杀基因疗法可以大大提高抑制肿瘤生长的功效，同时使得前体药物的用量减半。大量资料表明双前体药物对肿瘤细胞的杀伤作用要强于单前体药物。但也有资料显示双自杀基因之间可能存在拮抗效应。在体外实验中，单独加5FC的细胞杀伤最强，要高于5FC和GCV都加的组，而单独加GCV的细胞杀伤力最低， CD和TK之间没有协同作用，反而可能会相互干扰各自功能的运行。原因可能有两个方面：(1)可能是融合基因yCDglyTK在同时加5FC和GCV时，CD/5FC和TK/GCV两种系统的功能出现拮抗效应;(2)可能是在yCDglyTK融合基因中，由于某种原因，CD和TK的活性在这个融合基因中得到提高，使CD/5FC和TK/GCV两种系统的抑瘤能力同时或其中一种得到增强。当E.coli CD和HSV1 TK基因同时在一种细胞中表达时，会存在相互干扰作用。这种干扰作用的机制到目前还没搞清楚，但干扰作用可能不是发生在基因的转录期，而是在转录之后，TK介导的5FUMP的磷酸化会产生无毒的5FdUDP和5FdUTP，而不是毒性产物5FUDP和5FUTP，从而减低了CD/5FC的细胞毒性作用;或者CD介导的对GCV，ACV等的脱胺反应减低了TK/GCV系统的细胞毒性。yCD/UPRT基因中UPRT的酶活性与单独的UPRT酶活性大致相等，但是yCD/UPRT基因中的CD酶活性要高于单独CD酶活性100倍。这种酶活性的改变可能与这3种酶的蛋白质特性不同有关。加入不同浓度的前体药物5FC，GCV或5FC+GCV于电转了pcChCDTK的人视网膜母细胞瘤Y79细胞培养5d， SNK检验表明，与未转染的细胞对应浓度组比较，当5FC浓度达到100mg/L后各对应浓度平均细胞存活率组间均存在差异(PGCV >5FC。在本实验中，单前体药物对双自杀基因CDTK载体转染的Y79细胞均有杀伤作用，但双前体药物的杀伤作用要强于单前体药物。分析产生这种结果的原因，我们认为：(1)双自杀基因载体具有很强的催化前体药物向细胞毒物转化的能力;(2)这可能与我们加入的CMV增强子能大大促进hTERT启动子启动下游目的基因的表达有关，因为CMV增强子具有强大的增强转录能力，且没有组织特异性。
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2生物技术在动物病菌检测中的应用
2.1基因检测动物体内的病菌基因检测技术是利用基因标记的方法，通过基因芯片对被测者细胞中的DNA分子进行比对，分析被检测者是否含标记基因的一种技术。它可以在活体动物的分泌液中检测病毒的存在。如果禽类死亡后，仅仅从表型性状难以判断其是否患有禽流感，而基因检测就是一个重要的判断手段。采集活禽的咽喉分泌液或粪便、死禽的肌肉或组织脏器作为样本，采用RT-PCR基因检测技术判断样本中是否存在禽流感病毒，为病情的判断提供可靠的证据[7]。2.2生物传感器用于细菌性疫病的检测近年来，生物传感器的研究和它在工程技术领域的应用倍受关注，它主要是将生物活性材料（酶、蛋白质、DNA、抗体、抗原、生物膜等）与物理化学换能装置有机结合，利用生物活性物质的高度选择性，来检测生化物质和细菌性疫病。Bourette等将抗E.coli抗体固定在有孔氨丙基玻璃珠上，构造了流动注射免疫传感器，对E.coli进行检测，时间短且灵敏度高[8]。美国Rochester大学医学中心的研究人员从细菌中提取了一种蛋白质作为感觉系统制成硅片探针，如果靶细菌存在就会与探针样本结合，通过相机拍摄探针，便能俘获靶细菌的相关信息，从而进行分析[9]。Kim等建立了沙门氏菌压电免疫生物传感器，通过抗体包被的顺磁小球的磁力加强作用可以检测到鼠伤寒沙门氏菌，而且整个检测过程能在1h内完成[9]。
3生物技术在动物疾病诊断中的应用
3.1对细菌病的诊断猪链球菌是一种重要的共患病的病原菌，对养猪业和人都有严重危害。用传统的病原体分离技术结合血清学试验，能够对猪链球菌进行诊断和血清分型，但该方法工作量大，费时费力且敏感性不高，易产生非特异性结果。拜廷阳等[10]建立了SS9水解探针（TaqMan）模式的荧光实时定量PCR检测方法，与常规PCR方法相比，诊断更加迅速，整个反应可在1～2h内完成，且不需要电泳，其检测灵敏度是常规PCR方法的100倍，并能实现对样品的实时定量检测。3.2对病毒病的诊断动脉炎病毒是引起母猪繁殖障碍和仔猪呼吸症状的一种重要病毒，其突变株可引起高致病性猪蓝耳病，给养猪业造成了巨大的经济损失。刘圆圆等[11]根据该类病毒在Nsp2基因1594～1680处缺失87个碱基的特点，设计了一对特异性引物，利用TaqMan探针，成功建立荧光定量PCR检测方法。该方法不仅特异性强、灵敏度高、能很好地区分高致病性猪繁殖与呼吸系统综合症病毒和其他病毒，而且没有发现假阳性和假阴性现象。
4生物技术在动物疾病治疗中的应用
基因治疗技术可将正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入靶细胞，以纠正基因缺陷或者发挥治疗作用[12]。1990年，第1例基因治疗的成功使得利用基因工程治疗疾病成为现实。目前，基因治疗越来越多地受到科学界的关注。4.1基因治疗药物研制重组腺病毒-p53抗癌注射液是我国和世界上第一个基因治疗药物。它的研制成功开创了基因治疗药物研究的先河，这种广谱的肿瘤基因治疗类新药能够杀灭癌细胞，可与放疗、化疗、热疗协同作用，具有抑制肿瘤血管形成、激活患者免疫功能的作用[13]。4.2动物疾病治疗基因治疗在动物疾病治疗中应用于多个方面。临床上主要用于治疗血液方面的疾病，其基本策略是把一些与血管生成有关的因子如血管生成素-1（Ang1）和人肝细胞生长因子（HGF）等通过合适的传递系统转移到靶细胞，使其在靶细胞内有效表达，从而达到治疗因相关因子缺乏而引起的疾病的目的。此外，还可以治疗某些炎症和内科疾病[14]。目前，基因治疗的有效性已在体外及动物实验中得到证实，部分临床试验亦取得了令人鼓舞的结果。基因治疗作为一种新的治疗手段，已从理论走向实践，但还有许多问题有待解决。
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肿瘤是机体中正常细胞在不同始动与促进因素长期作用下，所产生的增生与异常分化形成的新生物。随着疾病谱的改变，肿瘤已成为目前导致死亡的常见原因之一，随着现代科学技术的发展和突飞猛进，给科学技术方法研究带来革命性变化，肿瘤逐渐地被看成为一种全身性疾?S纱硕矗琢鲋瘟乒勰畋惴⑸嗣飨缘淖颍琢鲎酆现瘟葡低彻塾υ硕＜创酉低彻鄣慕嵌雀莶∪说幕遄纯霾±聿∑谟敕⒄骨魇?有计划地、合理地综合应用现有的各种治疗手段，以期较大幅度地提高病人的生存率，改善病人的生存质量。
1 肿瘤发生、发展的系统观
所谓系统是指若干要素按一定的结构相互联系组成具有特定的功能的有机整体，而这个整体本身又是它所从属的一个更大系统的一个组成部分。系统科学的观点，就是要求把研究对象视为系统，把事物的普遍联系和永恒运动看成一个整体过程，全面的把握和控制，综合的探索系统中要素与要素、要素与系统、系统与环境、系统与系统的相互作用和变化规律，把握住对象的内环境与外环境的关系，以便有效地认识和改造对象［1］。任何系统都是开放的系统，每一个系统的存在都有整体性、层次性及动态平衡性等基本特征。一个生物学意义上的人，也完全可以看成是一个开放系统。这一系统本身就由各个子系统（循环、呼吸、消化等系统）组成，各系统之间并非独立存在，有相互影响、相互制约的作用关系，这一大系统和外界进行不断的物质和能量的交换，借以维持自身的稳态，达到功能的最优化，即生存质量最佳化。所以有学者认为：决定疾病发生发展的，不仅仅在于器官、组织、细胞、基因等各种要素的性能，更重要的是要素和要素之间，系统和环境之间的相互联系和作用，考察疾病的本质，必须把注意和焦点放在相互联系和相互作用上［2］。上述说法就是从系统水平进行考察，而不同局限于单个细胞或基因的功能行为。那么，在肿瘤的发生学上，是否肯定“基因决定论”的观点呢？近几年的研究提出，细胞基因的缺失、突变等导致的细胞生长失控、恶变是发生肿瘤的主要机制。从分子水平看，肿瘤的病因主要有癌基因的激活和抑癌基因的失活，细胞周期调控基因的改变，前者是发病的基础，并通过后者发挥作用。但对于这么一个子系统（核酸系统）的考察，并不能完全解释肿瘤的发生。核酸系统之间，核酸与蛋白质系统之间，核酸与神经-内分泌系统之间，核酸与内、外环境之间均存在着千丝万缕的联系。癌基因的激活和抑癌基因的失活并不会无缘无故发生，研究已表明，肿瘤的发生和发展是一个多基因、多步骤、多因素的渐进过程。环境污染致癌因素的刺激，化学致癌因素如苯、氯霉素、亚硝酸胺的影响，物理致癌因素，肿瘤的病毒病因，其他如人体内分泌失调、遗传、慢性刺激和创伤均可致瘤。而且单因基因突变而产生的肿瘤细胞也未必能发展成肿瘤，在人体这样一个复杂的系统中，神经-内分泌-免疫等内环境随时进行警惕的监视，只有整个大系统紊乱，监视功能障碍，肿瘤细胞才能逃脱系统监视，才能进一步发展。而真正发展到器官的癌变，往往要经历数年甚至几十年的时间，因为一旦系统的功能恢复正常，肿瘤细胞可被机体清除，只有在内外环境的反复作用下，机体各系统功能的紊乱无法再协调一致，才使得肿瘤得以发展甚至转移。综上所述，肿瘤的发生和发展并非“基因决定论”可以完全解决，相反的，只有从系统的整体的水平去考察外界环境和机体的作用，机体自身各个子系统的相互作用，每个子系统内部各要素的相互关系，才能很好地认识其病因和发病机制。
2 系统方法论原则对肿瘤治疗的思路指导
进入20世纪之后，医学渐渐进入理性阶段。随着对肿瘤本质认识的不断深入，更由于肿瘤局部治疗方法的停滞不前，局部治疗后预后不佳，使更多的学者意识到局部治疗的弊端。20世纪80年代，恶性肿瘤的治疗方式有手术、放疗、化疗、生物治疗，其中以根治性手术为主，对失去手术机会的中晚期恶性肿瘤只通过单一的放疗或化疗来延长生存期，有效率低，易于复发，治疗手段单一。80年代后期，由于化疗药物的不断推陈出新，肿瘤学理论的不断完善，化疗的地位日益被重视，发展了诱导化疗、术后化疗、放化疗、热化疗等各种综合治疗模式，手术方式也由根治性手术向保守性手术、保留器官功能方向发展，因此，21世纪的肿瘤治疗更注重强调根据病人的身体状况、肿瘤的病理类型、侵犯范围（病期）和发展趋向，有计划合理地应用现有的治疗手段，以期较大幅度的提高治愈率，改善病人的生活质量，肿瘤治疗观念由此发生了根本性的转变，肿瘤综合治疗应运而生［3］。所谓肿瘤综合治疗是指：根据病人的机体状况，肿瘤的病理类型，侵犯范围（病期）和发展趋势，有计划地、合理地应用现有的治疗手段，制定个体化治疗方案，以期大幅度地提高治愈率，改善病人的生存质量［4］。可以说，肿瘤治疗学研究显示出多学科的合作与补充，肿瘤的治疗也已进入综合治疗的时代。按照系统论整体性原理来讲即系统论中各组分相加的和大于各组分的代数和。恶性肿瘤综合治疗个体化的决策，将手术、化疗、放疗、中医中药治疗及生物基因治疗，依照不同病例特点，进行有机组合，以期达到最佳的治疗效果［5］。但它不是将各种治疗手段的简单叠加或随意轮番应用，孰先孰后，孰轻孰重，均要因人而异，要经过多学科的充分讨论协商后决定。在决策过程中，既要注意尽量避免盲目一味强调某一学科在肿瘤治疗中的重要性和单一治疗方法在肿瘤治疗中的过分扩大应用，又要注意各个学科之间的密切合作，相互配合，互补应用，共同来承担对患者的综合治疗。这就要求无论是哪一个学科的医生，都要做到不仅能够了解自己本学科治疗手段的特点和不足，还要了解其他相关学科治疗手段的特点和不足，真正做到心中有数。要能够善于应用其他相关学科的成果和特长来对自己本学科的治疗加以充实、完善和提高。特别是在科学技术迅猛发展和技术更新速度不断加快的今天，及时了解并掌握专业技术的发展动态和引进先进技术并加以应用与创新，以跟上时代和科技发展的步伐。当前，越来越多的肿瘤病人首诊时都选择到肿瘤内科，主要是因为肿瘤内科的医生能够善于接受和利用新的医学研究成果，以病人利益为重，改变过去谁先接诊谁收治的不规范医疗行为，在对肿瘤病人的诊断以及设计和规划总体治疗策略上起到了主导作用，不仅能够使肿瘤病人真正享受到现代肿瘤综合治疗模式与治疗方案个体化所带来的益处，而且也充分体现了社会的文明进步与人文关怀［6～13］。 我们在临床工作中必须要按照医学伦理学“ 医乃仁术”和“ 循证医学”，谨慎、准确和明智地应用当前所能获得的最好的研究证据，结合个人的专业技能和多年的临床经验，考虑病人的经济承受能力和意愿，并将此结合最优化的原则来作出具体的治疗决策。例如目前放化疗综合治疗的临床应用多集中于头颈部癌、食管癌、乳腺癌以及肺癌中，通过放化疗综合治疗所获得的较高的局控率和较晚发生远处转移，为我们提供了一条中晚期恶性肿瘤治疗的新途径。静脉化疗起到了全身治疗的目的－在于彻底清除微小转移灶，放疗作为一种局部治疗，二者联合应用的优点不言而喻，中晚期恶性肿瘤传统的单一治疗模式已远远不能适应目前临床要求，放化疗综合治疗不仅提高生存率，对延缓发生远处转移也显示出了不可比拟的优越性，尤其是同期放化疗的应用将中晚期恶性肿瘤的治疗带上一个新的台阶［14］。
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随着分子生物学技术的发展，作为生物医学前沿的人类基因组计划研究步入实质性阶段，基因治疗肿瘤成为热门。基因治疗能否给人类带来巨大的革命，已成为现代医学大家的研究方向。所谓基因治疗是指把目的基因导入靶细胞和宿主体内，通过基因组合，成为宿主遗传物质的一部分，纠正错误的基因表达和基因表达的错误，以达到治疗的目的［15］。通常包括四方面的内容：基因修正-纠正缺陷基因的突变碱基序列；基因置换-由正常基因换掉疾病基因；基因修饰-将目的基因导入病变细胞的基因，其表达产物用以修饰缺陷基因导致的细胞功能异常，或使正常功能得以加强；基因失活-应用反义技术封闭不该表达的基因，以抑制有害基因，或直接抑制有害基因的表达。虽然就基因治疗的概念来说，体现的是分子水平的基本理论和原则，但其治疗的目的是为了抑制肿瘤的生长或达到逆转、杀死肿瘤细胞，所以在治疗过程中仍需考虑所作用的个体系统，如外界的环境因素，机体的内环境和免疫功能的影响等。因为将基因导入细胞，使正常基因得以表达，或使病变基因不表达，或诱导已有的肿瘤细胞分化、凋亡，都不是单单一个分子水平可以解决的。例如将反义基因导入细胞，以封闭有害基因的表达，在体外实验中，所要观察的指标限于细胞水平，如基因转染的百分率，对肿瘤细胞生长和抑制率等。但一旦进入体内实验阶段，就不能不考虑机体的整体性，如反义核苷酸对肿瘤细胞有抑制作用，那么对正常细胞或组织器官是否有毒性作用呢？在体内，在各种调节机制的作用下或各种核酸酶等水解酶的作用下，反义核苷酸是否能成功地进入细胞封闭有害基因呢？再如用逆转录病毒载体介导的基因转移有效性高并容易获得稳定表达，但这一插入突变是否会引起潜在的癌基因激活，从而又引发新的肿瘤呢？显然，在肿瘤的基因治疗的研究中，在体外细胞水平中有良好的效应，但进入机体系统中，其效果不一定良好，而且历史上也有基因治疗失败的例子。这正是因为人体是一个复杂的系统，各个子系统之间有复杂的相互关系，而肿瘤的发生和发展也并非由基因单独决定，如果单从基因这一方面去考虑，而忽略了治疗所处的整体环境，忽略了治疗应采取的整体措施，往往会导致实验的失败。任何对肿瘤疾病的治疗方法需经过人体内试验，要从系统和整体的水平观察治疗有效性和可能存在的副作用，肿瘤基因治疗也需遵循系统观点，用整体性、动态性、联系性的原理，达到最佳的预期效果。但在实际工作中，尚有许多疑难问题，对于这些问题解决离不开系统科学观的支持，我们不能忽视机体的整体性，不能用局限、部分、分子细胞水平来以偏概全，只有用系统的环境中解决这些难题，才会有实用价值和临床价值。所以从肿瘤的综合治疗可以看出，综合手术、化疗、放疗及生物基因治疗、中医中药治疗、内分泌治疗等手段，依据具体情况具体分析的原则，针对具体的病例，制订相应的个性化的治疗方案，最终达到最佳综合疗效，在某些领域已显示了令人鼓舞的前景。随着人类基因组计划的完成，人类表观基因组协会（humnan epigenome consortium， HEC）在2003年10月正式宣布开始实施人类表观基因组计划（human epigenome proiect， HEP） ，通过大规模检测人类基因组，基因组学研究进入一个新的阶段，也为解开生命奥秘及征服肿瘤等疾病带来了希望［16］。人类攻克癌症近在咫尺，但仍有很长的路要走，尚有不少难题有待在今后实践中予研究解决。让我们记住著名的系统科学家拉兹洛教授的话：“今天我们正目睹一场思维方式的转化：转向严谨精细而又整体的理论。这就是说：要构成拥有它们自己的性质和关系集成的集合体，按照同整体联系在一起的事实和事件来思考。”［17］。
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中图分类号：R273文献标识码：A
文章编号：1007-2349（2011）11-0085-03
非小细胞型肺癌（nonsmallcelllungcancer，简称NSCLC），是发生于肺部的常见癌症。根据病理学组织结构，可分为鳞癌、腺癌、大细胞癌等不同类型，约占肺癌总数的80~85%[1]。目前治疗以西医治疗为主，其中以手术治疗、放疗、化疗为主要治疗手段。中医作为辅助疗法不但可减轻放、化疗所致的毒副作用，而且有利于放、化疗顺利进行，在延长生存期等方面取得了较为满意的疗效。从总体治疗效果看，NSCLC的临床治疗已取得很大进展。本文就NSCLC的临床中西医治疗进展与展望作一综述。
1外科治疗
11一般手术治疗一般手术治疗仍然是目前治疗早期非小细胞肺癌最理想的方法。手术方法有肺叶切除、一侧全肺切除、袖式肺叶切除、气管隆凸再造、气管-肺动脉成形术等手术方法。同时需高度重视淋巴结清扫，只有通过系统肺门和纵隔淋巴结清扫才能达到完全切除和标准分期的目的。
12微创胸外科手术治疗目前，肺癌微创外科技术主要有3种手术方式，即视频辅助胸腔镜手术（video-assistedthoracoscopicsurgery，VATS）、机器人辅助胸腔镜手术（robot-assistedthoracoscopicsurgery，RATS）和保护胸壁肌肉的小切口开胸手术（muscle-sparingminithoracotomy，MSMT）。（1）VATS：目前中国多家胸外科中心已开展VATS肺癌切除术，在2008年第8次全国胸心血管外科学术会议上，华西医院刘伦旭介绍了更具有操作性、更加规范的“单向式胸腔镜肺叶切除术”，标志着中国VATS肺癌切除术的成熟。（2）RATS：近年，机器人已被引入外科手术中，这揭示了未来胸外科的发展趋势和方向[2]。2006年美国纽约纪念医院[3]报告了34例RATS肺叶切除的临床资料，无手术死亡，4例（12%）中转开胸，平均清除4组淋巴结，中位手术时间218min，中位胸腔引流时间3d，中位住院时间45d。（3）MSMT：随着器械外科技术的进步和小切口下手术操作技巧的提高，经MSMT可方便地施行与传统开胸手术相同的解剖性肺切除和系统淋巴结清扫，已能对绝大多数具备手术适应证的肺癌实施根治性切除，获得与传统后外侧切口肺癌切除术相同的治疗结果。
2化疗
目前化疗方案大致可分为两类：以铂类药物为基础的双药联合方案和不含铂类药物的方案。（1）以铂类药物为基础的双药联合方案是目前治疗NSCLC较常用的一种手段，药物的组合方式也有多种，铂类联合新药是目前治疗的首选方案[4]。对于有良好预后因素的晚期NSCLC患者采用联合顺铂与健泽、紫杉醇、异长春花碱化疗取得了令人满意的有效率；对于没有良好预后因素或老年患者，采用异长春花碱、健泽或紫杉醇单药治疗更为合适[5]。（2）不含铂类药物的方案药物主要是紫杉醇、多西他赛、泰素帝、吉西他滨等。目前最引人注目的方法是“TXT”（泰索帝）75mg/m2（毫克每平方米体表面积）单一药物治疗[6]。
3放疗
根据目前的研究，放疗可分为术前放疗、术中放疗和术后放疗3种方法。术前放疗的目的为清除手术区域以外的亚临床病变，减小肿瘤体积以及相邻组织之间的浸润，减少局部种植和转移的机会，以提高切除率和生存率。但是临床实践显示上述目的未能达到，并没有使患者受益，临床上已不常规采用[7]。术中放疗的目的是降低局部复发率，是近年发展的在手术残留部位以电子线进行的一次性大剂量（15gy～25gy）照射，手术伤口愈合后再行体外高能放疗。术后放射治疗可提高生存率，对于手术中癌肿组织未能全部切除或支气管断端残留癌浸润的病例可放置金属标记行放疗。
4分子靶向治疗
分子靶向治疗比传统的化疗具有更高的选择性，毒副作用小，是今后肿瘤治疗的新趋势[8]。目前临床应用的分子靶向治疗药物主要有以下3类：（1）作用于表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂是一种跨膜蛋白，为原癌基因EerB1（Her21）的表达物。这类药物包括易瑞沙和埃罗替尼等多种药物。（2）作用于血管生成的靶向药物是一种重组人源化抗血管内皮生长因子单克隆抗体，由培养在含庆大霉素培养基中的中国仓鼠卵巢哺乳细胞表达体系生产。这类药物主要有贝伐单抗等。（3）多靶点治疗药物是一种口服多靶点治疗药物，能选择性地抑制血管内皮生长因子依赖的肿瘤血管形成，而且对表皮生长因子受体也有一定抑制作用。这类药物有ZD6474等。
5免疫治疗
51主动免疫疗法主要有非特异性主动免疫疗法和特异性主动免疫疗法。（1）非特异性主动免疫疗法：目前主要应用具有免疫调节作用的刺激因子通过非特异性的作用激发机体的免疫系统，增强抗肿瘤的免疫应答。如卡介苗、短小棒状杆菌、左旋咪唑等，也可用细胞因子如白介素-2、白介素-4、干扰素、肿瘤坏死因子等。但由于肺癌的肿瘤抗原性不强，目前这种治疗难以取得明显效果。（2）特异性主动免疫疗法：随着对肿瘤免疫研究的深入，肿瘤疫苗和抗独特性抗体作为疫苗的发现使特异性主动免疫疗法成为可能[9]。某些抗独特性抗体与抗体上的抗原相关位点结合，能够模拟外来抗原，作为免疫治疗中替代性抗原。
52被动免疫疗法主要有过继免疫疗法和抗体疗法。（1）过继免疫疗法：目前肺癌的过继免疫疗法可以应用淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）输入体内或局部应用于癌性胸水，对延缓病情的发展有一定的效果，但单独应用治疗效果不佳。还可以应用肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL），通过基因修饰的TIL进行治疗。实践证明TIL的疗效比LAK要更好。（2）抗体疗法：目前抗体疗法正成为肺癌的另一研究热点，它已成为肺癌综合治疗的一部分。运用相应的单克隆抗体与异常表达的癌基因产物结合可以阻断癌细胞的异常信号传导通路，从而阻止癌症的发展[10]。
6介入治疗
目前介入治疗在NSCLC应用的方法主要有两种，即经支气管动脉灌注化疗和支气管栓塞治疗。经支气管动脉灌注化疗可有效提高肿瘤局部药物浓度，提高抗癌药物的解毒作用，同时又可以减少或阻断肿瘤的血供，使其缩小、坏死。支气管栓塞治疗可通过介入放支架解除肿瘤引起的中心气道狭窄或阻塞，对继发于肺癌的上腔静脉综合征患者血管内置人支架是较好的方法。
7基因治疗
基因治疗在该病所应用的方法主要有[11]诱导特异性免疫的基因治疗和直接作用的基因治疗两种。诱导特异性免疫的基因治疗即输送生物活性基因来改变癌细胞的局部免疫环境，增加癌细胞的免疫原性和T细胞的反应性，改善抗原提呈和提供缺失的旁分泌。由于免疫性诱导是遗传性系统性的，同时靶子来源于肿瘤抗原，因此所诱导的免疫性具有潜在发现和杀死没有经过基因修改的肿瘤细胞。这一特点可能对以远处转移为主要问题的肺癌具有重要意义。直接作用的基因治疗主要有抑癌基因的治疗、药敏感性基因治疗和反义cDNA和寡核苷酸技术3种方法。
8中医药治疗
中医学侧重辨证施治，从整体调节入手，目前中医药在治疗肺癌中，特别是在NSCLC的防治方面主要有以下作用：（1）防治手术、放疗、化疗副反应；（2）配合手术、放疗、化疗减毒增效；（3）在抗非小细胞肺癌复发和转移的综合治疗中起很重要的作用；（4）不能手术、放疗，不宜再化疗的肺癌患者，中医起主导作用，即改善症状、提高生存质量、延长生存期[12]。
81病因病机中医学认为，肺癌属“肺积”“痞癖”“咳嗽”“咯血”“胸痛”等范畴，病位在肺。学者们对其病因病机虽然有不同的认识，但无外乎正气虚损和邪毒内积两个方面，本病病变部位在肺，与脾、肾有关，病理因素主要为气滞、痰浊、瘀血、热毒，病理性质为本虚标实，虚实错杂。在治疗过程中，扶正培本为其关键。
刘丽坤等[13]认为，肺癌的基本病机为正虚邪实。正虚是肺癌发生的基础，是复发、转移的关键，其中肺阴亏虚贯穿疾病的始终，痰瘀毒结是肺癌的主要病理表现。刘嘉湘认为肺癌总属本虚标实，由于正气先伤，邪气得以乘虚而入，聚积于肺，导致气滞血瘀、聚液为痰、痰瘀交阻而渐成肿块。高萍等认为放化疗副反应是毒邪内侵，损害肝脾肾等脏腑功能，耗伤机体气血津液，导致气血阴阳的失调与缺失。
82辨证分型中医将肺癌看作是全身性疾病的一个局部表现，主要根据症状和体征对肺癌进行辨证分型，治疗上强调全面调整人体机能。目前主要依据阴阳盛衰、气血的虚实、脏腑病机以及邪毒性质进行归类分型。这些证型基本反映了肺癌病情发展不同阶段的一些规律。刘嘉湘对405例非小细胞肺癌病例进行研究，其中阴虚和气阴两虚型占肺癌的726%，指出肺癌的病机特点以阴虚和气阴两虚为主。杨国旺等将肺癌划分为气虚、阴虚、阳虚、血虚、痰湿、血瘀、毒热7个基本证型。李忠等研究发现以气阴两虚及痰瘀互阻证型最为常见，其他依次为脾虚痰湿、肺脾气虚、气虚血瘀、痰湿阻滞等。孙士玲分为肺脾气虚、肺，胃阴虚、肺热痰湿、气滞血瘀型。
83中成药中医药作为一个辅助疗法，在非小细胞肺癌的治疗中起到了很大的作用。随着中药制剂现代化研究，研制成了很多中成药，有很好的临床疗效。目前临床上使用的口服中成药有固本消瘤胶囊、乾坤胶囊、平消胶囊、抗瘤冲剂、仙露冲剂、中成药鹤蟾片、参一胶囊等。治疗NSCLC的中药静脉制剂主要有康莱特注射液、参麦注射液、丹参注射液、艾迪注射液、华蟾素、榄香烯、岩舒注射液等。
9回顾与展望
非小细胞肺癌的手术、放疗、化疗和生物治疗等在临床治疗上已经取得了很大的进步，但是治疗效果仍不能令人满意。中医药作为一个补充治疗手段和方法正起到越来越重要的作用。中医的整体观从大局出发，提倡提高机体正气抗邪，防止病情进展，正弥补了西医重局部的不足。中医药治疗肺癌的疗效以病灶稳定率较高、生存期较长、改善生活质量较好为主要特点，在抗复发转移，减负增效方面有一定的优势，对于已无放化疗机会晚期肺癌患者，中医药治疗是缓解疾苦的主要手段。但是中医治疗在很多方面还不完善，比如辨证分型缺乏统一的认识，临床应用个案报道数量较多，缺乏大样本、多因素的观察，循证医学证据并不充分等。
笔者认为目前西医治疗一方面微创手术研究是未来外科手术的发展方向，另一方面靶向治疗、免疫治疗和基因治疗都是肺癌多学科治疗中新的研究和应用热点，日益受到重视，是以后发展的方向。要注意提高药物疗效，降低毒副作用，延长患者（尤其是晚期肺癌患者）的生存期。中医治疗应从扶正祛邪，整体调节入手，应特别重视调补肺脏功能兼顾调整五脏功能。具体来说，整体方面要调理饮食，注意饮食平衡；调理药物，注意药物之间的平衡，勿太过不及；调理五脏功能，勿偏盛偏衰。局部方面要注意调整肺脏本身的功能和调整脾胃功能。中医认为“人以胃气为本”、“脾胃为后天之本，为气血生化之源”，脾胃功能好坏对疾病的预防和治疗都有很重要的作用，尤其在肺癌的防治中更是具有重要价值。未来该病的治疗必将走上一条中西医互补的道路，因而希望能够多学科配合、大胆摸索、反复实践，更好的发挥中西医结合在NSCLC预防治疗中的特色和优势，从而对人类防治NSCLC整体水平的提高起到积极地推动作用。
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篇7
引言
烟草中含有尼古丁本是人类健康的杀手，却可以改造成生产医用蛋白的植物；喷洒除草剂时，只杀死田间杂草而不损伤农作物；新鲜番茄的储存期可延长1～2个月；干扰素、乙肝疫苗等基因工程药物的批量生产，这些都不再是奇思妙想，而是基因工程带给人类的福音。文章从基因工程应用对人类的积极影响和可能存在的消极因素两方面进行探究。
1 基因工程应用的积极影响
基因工程的应用，在人类解决“粮食短缺”、“环境污染”、“攻克不治之症”等问题方面已取得了一些重大成就，正在发挥着越来越重要的积极影响。
1.1 改良品质提高产量，解决粮食短缺
基因工程在农业生产领域的应用是最为广泛和成熟的，已经被认为是目前全球提高粮食产量、提升粮食品质和消灭贫困的重要途径。基因工程也为培育出抗病虫害、抗旱、抗涝、抗严寒、高产量等优质的新品种提供了技术手段。
1.1.1 抗虫转基因植物。使用抗虫基因防治虫害，已成为防治农作物害虫的发展趋势。目前常用的抗虫基因源有苏云金杆菌（Bt）、蛋白酶抑制剂、植物凝集素以及淀粉酶抑制剂等。近几年，科学家还在研究利用昆虫神经激素基因来防治害虫。目前获得的抗虫转基因植物已经有几十种，主要有棉花、水稻、玉米、小麦、烟草、马铃薯、番茄、大豆、苹果等，其中有些已进入大田实验，有些已进行商业化生产。转基因技术不仅避免了大量使用农药造成的环境污染，也减少了农药对人体健康的损害，降低了生产成本。
1.1.2 抗病转基因植物。许多栽培作物自身缺少抗病毒基因，转基因技术为培育抗病毒植物品种拓展了新途径。目前已经获得了抗病毒的转基因小麦、甜椒和番茄等多种作物，极大地降低了这些植物的病害率，提升了农作物产量和品质，提高了土地的利用率。
1.1.3 抗逆转基因植物。利用调节细胞渗透压的基因来提高农作物抗旱、抗盐碱能力，培育抗干旱、耐盐碱等抗逆性能良好的农作物，提高盐碱、干旱土地的农作物产量，以缓解全球因人口增长和环境恶化造成的土地紧张问题。将抗除草剂基因导入大豆、玉米等农作物中，在喷洒除草剂时，只会杀死杂草而不会损伤农作物。
1.1.4 改良植物的品质。随着人们生活水平的提高，人们已不仅仅满足于吃饱，而是要讲究营养。利用转基因技术，科学家将富含赖氨酸的蛋白质编码基因导入玉米，使玉米的赖氨酸含量提高了30%，极大地提高了其营养价值；应用转基因技术，甚至可将新鲜番茄的储存时间延长1～2个月，目前这种耐储存番茄已进行商品化生产，转基因技术已经进入了人们的日常生活。
1.2 改善畜产品的品质，调控营养结构
转基因技术的运用能将牛分泌的乳汁中乳糖含量降低，而其他营养成分不受影响，很好地解决了有些人特别是婴儿食用牛奶后对牛奶中乳糖不消化，或食用牛奶后出现过敏、腹泻、恶心等不适症状的问题。
1.3 开创医药新研究，提高大众健康水平
1.3.1 基因工程药物异军突起。基因工程制药不仅具有独特的优势，发展速度也很快。目前通过DNA重组技术已大量高效地生产出多种人类蛋白药物，如胰岛素、干扰素、白细胞介素、人生长激素、红细胞生成素、肿瘤坏死因子等，基因工程药物的研究为人类战胜多种疑难疾病提供了有力的武器。
1.3.2 基因治疗曙光初照。基因治疗是将正常基因导入患者体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。目前，基因治疗是世界上治疗遗传疾病的最有效的方法。用于基因治疗的基因包括三类，第一类是从健康人体内分离得到功能正常的基因，用以置换病变基因，弥补病变基因带来的生理缺陷。这类基因常用以治疗各种基因缺陷型遗传疾病如地中海贫血病和血友病等；第二类是反义基因，主要用于治疗获得性分子疾病。通过反义基因产生的mRNA分子，与病变基因产生的mRNA进行互补，从而阻断非正常蛋白质的合成；第三类是自杀基因，这是一类编码可以杀死癌变细胞的蛋白酶基因。目前应用基因治疗在对恶性肿瘤、血友病、ADA缺乏症、艾滋病、糖尿病和各型肝炎等疾病的治疗中已取得了重大进展。
1.3.3 基因芯片诊断成为研究热点。与传统检测方法相比，基因芯片在临床诊断方面具有明显的优势。它不仅能在早期诊断中发挥作用，还可以在一张芯片上，同时对多个病人进行多种疾病的检测；使用基因芯片还能从分子水平上了解疾病。正是这些优势使得医务工作者能够在短时间内获取大量的疾病诊断信息，从而确定正确的治疗方案。基因芯片诊断凭借其高效、快速、自动化等特点，将成为现代化医疗诊断的一项新技术，并成为学术界的研究热点。
1.4 改善自然环境，为环境保护提供新手段
工业生产带来了很多环境问题，20世纪80年代基因工程技术就开始应用于环境保护，目前科学家已培养出了能够降解塑料、农药、防治重金属污染、清除石油污染等的基因工程菌。经基因改造的杨树在生长过程中，可清除土壤、地下水中重金属的污染，将可分解石油成分的基因工程菌接种到海滩，可清除海滩的原油污染，其清除速度比天然细菌快得多。[1]
2 基因工程可能存在的不利影响
目前由于缺乏大样本的科研数据和长时间的验证，人们对转基因生物可能存在的潜在危害或风险还知道得很少，因此，人们对转基因技术的应用还存在一些质疑与顾虑。
2.1 转基因食品的安全性问题
很多经基因改造的农作物和动物都经过加工成为食品，转基因食物已逐渐走进了人们的生活。虽然食物中的转基因本身并无安全性问题，但由于机体内生物化学变化纷繁复杂，有些反应需要经过很长时间才能表现出来，甚至有可能经历几代才能监测到。人们担心转基因食品可能对人体产生某些毒理作用和过敏反应，例如，转入的生长激素类基因就有可能对人体生长发育产生重大影响，所以目前社会上还有许多人抵制转基因食品，甚至有些国家还完全禁止转基因食品的播种与生产。
2.2 对生态环境的不利影响
转基因生物具有自然生物所不具备的生存优势，这些生物释放到自然环境后有可能会打乱物种间的竞争关系，进而破坏原有的生态平衡。另外，目前的生物技术还无法准确预测转基因生物体及其代谢产物的表现形态和潜在不利影响，因此也难以提出相应的防范策略。
2.3 对伦理道德的影响
倘若基因克隆技术应用到人类自身，将会打破传统的传宗接代的模式。父子、夫妻等基本的伦理关系会变得模糊不清，家庭成员关系将出现混乱，现有的社会秩序会被打乱，进而使人类现有的意识形态、法律制度、变得无所适从[2]，人类道德文明将受到威胁。
3 结束语
基因工程的广泛应用为人类社会带来了巨大的变革，转基因技术的影响已经深入到人类生活的各个方面，而且对促进全球经济发展以及增进人类健康方面必将发挥越来越大的作用。我们在分享基因工程为人类带来丰硕成果的同时，也不能忽视它可能存在的潜在的危害，对待基因工程的应用要趋利避害，不能因噎废食，应该不断探索，使基因工程技术能为人类创造出更高的价值。
参考文献
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[中图分类号]R394[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2007）10（b）-007-03
RNAi（RNA interfering，也称RNA干扰）是利用小双链RNA特异阻断特定基因的表达，并促使靶mRNA降解，从而使细胞表现出某种特定基因缺失表型的现象。由于RNAi对基因表达的阻断具有高效、特异性，已迅速发展成为代替基因敲除的遗传工具。
1 RNAi的分子作用机制
经过众多学者的研究，现已基本阐明了RNAi的作用机制。在不同生物中RNAi的作用机制各有不同,主要分为两种：大于30 nt（核苷酸，nucleotide,nt）的长双链RNA的非特异效应和21～23 nt的短双链RNA的特异效应[1]。RNAi的特异效应作用机制是在转录水平、转录后水平、翻译水平等多个不同的水平上实现的。其中以siRNA转录后水平的RNAi研究最为深入，应用最为广泛，下文将做主要介绍(图1)。
1.1 转录后水平的RNAi机制
转录后水平的RNAi机制是在对线虫、果蝇等生物体进行研究而进一步推导得出来的。不同研究领域的学者相继提出了多种RNAi机制的模型，这些模型大致都将RNAi分为两个阶段：起始阶段和效应阶段。
起始阶段包括：①dsRNA的导入：包括由外源导入或由转基因、转座子、病毒感染等各种方式引入的dsRNA;②dsRNA在细胞内被一种命名为Dicer的酶切割成21~23 nt长的小分子干扰RN断（short interfering RNA, siRNA）。
效应阶段包括：①在siRNA反义链指导下，双链siRNA与一个不同于DICER的RNA酶结合形成沉默复合物RISC。②siRNA双链解旋，正义链被释放出来，RISC被激活。③活化的RISC通过碱基配对识别互补的靶mRNA，siRNA反义链与mRNA复合体中换位，并在距siRNA的3'末端12 nt处切割靶mRNA，从而实现了对mRNA的降解。降解位点多为尿嘧啶。
某些学者认为RNAi过程中还具有自身循环放大机制，并将其归为模型的第三阶段――循环放大阶段，其机制大致如下：
在效应阶段，活化的RISC结合mRNA后，内切核酸酶将mRNA切割成12~23 nt的片段，特异性地抑制了靶基因的表达。同时，释放出来的siRNA可以作为一种特殊引导物，在RNA依赖的RNA聚合物（RdRP）作用下，以靶mRNA为模板合成新的dsRNA，后者又被降解为新的siRNA，进入上述循环，呈放大效应。此过程又称为随机降解性多聚酶链式反应（PCR）[2]。
1.2翻译水平的RNAi机制[1]
翻译水平上的RNAi是抑制相应mRNA的翻译，使相应的蛋白质表达受阻，其中起重要作用的是stRNA (small temporal RNA)，它是由长度约70 nt的RNA形成的茎环样前体，经Dicer酶作用后形成长约21～23 nt的dsRNA， 通过RISC结合在相应mRNA的3'末端非翻译区上,进而阻断mRNA的翻译。
1.3转录水平上的RNAi机制[1]
该机制是通过siRNA与互补的DNA直接发生作用，激发同源DNA甲基化的加强，使目的基因转录受限，表达关闭，进而加强了基因沉默。有报道dsRNA可诱导组蛋白H3及相应DNA区域甲基化。如果甲基化出现在启动子区域,则转录就不能进行,如甲基化出现在编码区,则转录进行,但在转录后水平上沉默。
1.4 非特异效应
许多研究表明，当向哺乳动物转染大于30 nt的长双链RNA（dsRNA）时，由于dsRNA激活双链RNA依赖的蛋白激酶（dsRNA dependent protein kinase, PKR）途径[3]，使EIF-2α因子磷酸化，进而非特异性地抑制翻译，从而使细胞内发生全面的细胞沉默。
1.5 RNAi过程所涉及的主要因子
siRNA：是RNAi作用赖以发生的重要中间效应分子。它是长约21~23 nt的双链RNA小分子，与靶mRNA序列具有同源性。此外，siRNA每条单链 的3'末端均有2~3个非配对的碱基[4]。
Dicer酶：Dicer酶（在果蝇中发现）是一种RNaseⅢ家族中的一种识别dsRNA的酶，据报道其结构含有1个PAZ结构域，1个氨基螺旋酶结构域，2个RNaseⅢ模体及2个dsRNA结构域。在dsRNA导入后，Dicer酶以ATP依赖的、持续方式连续切割dsRNA。在对dsRNA进行切割时，Dicer以二聚体形式参与，每个二聚体包括4个活性中心，在降解RNA时其中的2个要失活,从而使降解过程每隔一定间隔进行,这个间隔正好为22个核苷酸,即每隔22个核苷酸Dicer酶将dsRNA降解一次。而Dicer酶结构上的微小改变将会引起间隔的改变,所以不同的物种产生的siRNA长度也略有不同[1]。
RdRP：许多实验证明，RdRP是RNAi所必需的。RdRP目前仅知其主要是在单链siRNA指导下扩增RNA而加速RNA的过程。由于RdRP的存在，使RNAi能在低浓度下高效快速地进行。
ATP[5]：ATP在siRNA介导中起重要作用，dsRNA被降解为siRNA的过程需要ATP；siRNA解旋，反义链与RISC前体结合形成RISC的过程也依赖ATP。研究还发现，RNAi过程中外源性ATP不能起促进作用。
2 RNAi的特征
高稳定性：以3'末端突出的TT碱基的dsRNA尤为稳定，无需象反义核酸那样进行进行广泛的化学修饰以提高半衰期[6]。
高效率：在低于反义核酸几个数量级的浓度下，就能使目标基因的表达降到极低水平甚至完全抑制，从而产生缺失突变体表型[7]。
高特异性：siRNA除正义链3'末端突出的2个碱基在序列识别中不起主要作用外，其他单个碱基的改变均可能使RNAi效应大大减弱。而针对同源基因共有序列的RNAi则导致同源基因共同失活[5]。
高传递性：RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持，在某些生物中RNAi还可以传递到后代中去。
3 RNAi应用过程需要解决的几个问题
避免非特异性效应：前述已阐明，在哺乳动物中，当大于30 nt的dsRNA被导入时，可激活PKR途径而导致非特异性抑制。这就要求在设计dsRNA时必须考虑该dsRNA导入时能否避免非特异性效应的出现。多数实验表明，以21~23 nt为最佳选择。
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干涉dsRN段的获取和导入：在实际应用中，siRNA的长度、结构、组成及其触发的效果基因、种属、序列、细胞类型、甚至实验体系的不同而有变异。目前，siRNA的获取大多数仍旧是生化合成，其设计仍处于试验阶段，能否成功地设计出合理实用的siRNA对其能否广泛应用起决定性作用。对RNAi效应的调控：目前对RNAi的研究还限于以双链干涉片段抑制特定基因的表达，对其调控的干涉较少。但大量的研究表明，dsRN段的大小、潜在靶位、活性片段浓度等都是RNAi有效性发挥的影响因素。Yang等还证实RNAi现象可被过剩的不相关的dsRNA竞争性抑制，深入的研究表明，甚至过剩的正义链与反义链也可竞争性抑制RNAi效应。
4 RNAi的应用及前景
4.1遗传学研究的应用
4.1.1 稳定转座子RNAi缺陷可引起内源性转座子的移动。转座子的重要特征之一是具有反向重复序列，生物体通过此序列可以产生dsRNA发夹，启动PTGS效应，所以抑制转座子的移动有利于遗传稳定，防止遗传损害。因此人们认为RNAi的一个自然功能就是转座子沉默[8]。
4.1.2 基因功能分析人类基因组计划中的基因测序已经完成，人类将进入后基因组时代。其主要任务是确定基因的功能，因此迫切需要建立有效、经济的分析基因的技术。
尽管目前对RNAi机制并未完全弄清，但其高效、特异阻断基因的表达已在某些研究中开展。RNAi克服了传统基因功能分析技术要求高，过程繁等缺点，已吸引了越来越多学者的重视。可以预见，RNAi将成为新一代基因组功能研究的有力工具。
4.2 临床应用
4.2.1 抗病毒David等认为在动物中RNAi代表一种古老的抗病毒反应，与植物的PTGS（转录后的基因沉默）一样可抵抗病毒的感染，目前这一观点已被普遍认可。
目前，利用体外培养人类细胞研究抗病毒感染，主要限于单链 RNA病毒，包括人类免疫缺陷病毒、流感病毒、丙型肝炎病毒和脊髓灰质炎病毒等。Novina[9]等用针对CD4的siRNA转染Magi-CCR5细胞，产生了对CD4受体表达特异性抑制达75%，Northern杂交发现CD4分子的mRNA明显降低了8倍，从而阻断了HIV-1病毒细胞。Kapadie等[10]用针对HCV的siRNA与表达HCV的质粒共转染人的肝癌细胞株Huh-7细胞，2 d后，Northern杂交检测显示：HCV的RNA含量下降，证明了HCV特异的siRNA抑制了病毒的复制[9]。
RNAi在针对其他病毒，如呼吸道合胞病毒、SARS病毒、脊髓灰质炎病毒，猪瘟病毒等均显示出抑制病毒复制的作用。最近有文献报道RNAi在研制抗SARS药物中显示出特殊的作用。
从当前的这些研究结果可以看出，siRNA通过序列特异性干扰作用，能封闭病毒基因在体内的复制，RNAi成为控制病毒在细胞内复制的重要工具，为病毒治疗提供了新的思路。
4.2.2 抗肿瘤利用RNAi的高效率和高度特异性，我们可以设计特异siRNA分子，沉默目标基因，而正常基因不受影响。这是用RNAi抗肿瘤的基本思路。从现阶段研究的进展看来，RNAi有望成为新一代研究抗肿瘤的重要工具，发挥重要作用。
肿瘤是多因素、多基因的疾病，单个癌基因的抑制难以达到治疗效果，用基因敲除等方法进行治疗研究就造成了时间和经费的浪费。RNAi技术可同时抑制多个基因，且抑制效果互不干扰，并且RNAi识别可以精确到单个核苷酸，对由野生型突变形成的癌基因，如ras、p53等，能产生准确有效的封闭效果，而野生型不受影响[11]。Wilda等针对bcr/abl基因融合位点设计了一段21 nt长的dsRNA分子，特异性沉默了该融合基因，并使表达该融合基因的细胞凋亡，而对不表达该基因的肿瘤无任何作用。最近，Linsl等把针对bcl2基因的mRNA-cDNA杂交体转染到人前列腺癌lncap细胞中，产生了长时期的阻抑bcl2表达效应，这一效应与体外培养的前列腺癌细胞中的RNAi非常相似。
5 结语
RNAi的发现改变了人们对细胞基因调控的传统思路，提供了特异性阻断基因表达的新工具和评价基因功能的新策略，为人类基因功能研究和疾病基因治疗开辟了一条革命性的新领域。尽管其机制仍未完全弄清，但RNAi技术在病毒、肿瘤等尚未根治的疾病提供了新的治疗方案，并带来根治的希望。目前RNAi在各方面的研究已经日新月异，可以相信，不久的将来，将会出现基于RNAi的基因治疗药物，RNAi技术也将成为未来生命研究的重要工具。
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篇9
【关键词】 小干扰RNA; 结直肠癌; FAK; 细胞增殖; 细胞运动
[Abstract] AIM: To investigate the effect of siRNA targeting FAK gene on proliferation and motility of colorectal cancer. METHODS: Recombinant plasmids that produced siRNAs targeting FAK were designed and cloned， then transfected into Caco2 cells. The changes of FAK expression levels were examined by RTPCR and immunocytochemistry. The effects of FAK gene knockdown on apoptotic morphological changes， proliferation， and motility were investigated. RESULTS: Recombinant plasmids targeting FAK were successfully constructed， FAK mRNA and protein level was silenced in Caco2 cells significantly. The inhibition of mRNA level was achieved maximal at 48 h post transfection with time dependent. The ability of proliferation and motility of Caco2 cells were significantly decreased. CONCLUSION: Plasmidmediated FAK siRNA could inhibit FAK gene expression. The proliferation， motility and apoptosis were inhibited effectively， which suggested that FAK expression is closely associated with the proliferation， motility and apoptosis， etc. The results may be used as the reference for gene therapy of colorectal cancer.
[Keywords]small interfering RNA; colorectal cancer; FAK; cell proliferation; cell motility
近年来以黏附相关因子为靶点的治疗成为基因治疗研究的新策略[1]， 黏着斑激酶(focal adhesion kinase， FAK)是近年来发现的细胞黏附介导的信号通路的重要因子， 作为胞内信号蛋白酪氨酸激酶， 于1992年被独立鉴定为Src癌基因的底物。FAK的相对分子质量(Mr)为125 000， 定位于人染色体8q24， 与cmyc基因座接近， 此基因座在人癌细胞中往往被激活而强化[2]。FAK作为信号转导的关键分子， 可传递由胞外到胞内的多种信号， 其在结肠癌中表达升高而在正常组织细胞中表达呈弱阳性的特点开始引起研究人员的关注[3]。有研究显示， FAK基因在结直肠癌组织中表达升高[4]， 并与癌细胞增殖、 侵袭转移密切相关， 但作用机制还不明确。本实验将靶向FAK基因的siRNA表达载体导入Caco2细胞， 探索FAK siRNA对结直肠癌细胞增殖和迁移的影响并初步探讨其作用机制， 为结直肠癌基因治疗积累实验资料。
1 材料和方法
1.1 材料 人结直肠癌细胞株Caco2购于美国ATCC。重组质粒pU6H1GFP/FAKsiRNA为本实验室设计、 百奥生物技术有限公司(南通)构建， 大小为5.5 kb， 经测序正确。限制性内切酶Hind Ⅲ购自NEB公司。脂质体Lipofectamine 2000、 TRIzol试剂均为美国Invitrogen公司产品。RPMI1640培养基购自美国Gibco公司。胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自美国Amresco公司。RT007 AMV反转录酶购自杭州博日科技有限公司。FAK、 GAPDH引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。针对FAK的单克隆抗体(mAb)购自Santa Cruz公司。SP免疫组化试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司。Hoechst 33258购自南京凯基基因有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 siRNA的设计及构建 利用Ambion siRNA在线软件设计了2条针对FAK的siRNA: siFAK1: 5′GGGCAGACGAGACCACACTGA3′; siFAK2: 5′GAAATGGAAGAAGATCAGCGCT3′; 错义对照序列siRNASCR: 5′GCATCTAAGGTATCGTTGTGGCTC3′。经Blast比对证实与人其它基因无同源性后构建合成siRNA表达载体， 双启动子U6和H1之间插入人FAK及错义siRNA靶序列。
1.2.2 细胞转染 于6孔培养板， 将Caco2细胞接种于无抗生素、 含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液， 细胞接种密度: 2×105/孔， 饱和湿度培养24 h。参照Lipofectamine 2000说明书进行转染优化， 转染后6 h更换完全培养基。实验分为: 正常对照组(未转染的Caco2)、 错义siRNASCR组(非特异性siRNA转染)、 干扰组siFAK1、 siFAK2。
1.2.3 GFP表达检测及转染效率评价 转染后细胞于激发波长为488 nm的荧光倒置显微镜下检测GFP的表达情况。以放大100倍的视野为标准， 计5个视野表达绿色荧光的细胞数和总细胞数， 求GFP表达率: GFP表达率=发绿色荧光细胞数/细胞总数×100%。
1.2.4 细胞凋亡形态学检测 取对数生长期细胞以2×105/孔接种于铺有无菌盖玻片的6孔板中， 每组爬片4张， 转染48 h后弃培养液， PBS洗3次， 40 g/L多聚甲醛4℃固定15 min， PBS洗3次， 吸净液体， 每孔加入200 μL Hoeschst 33258工作液， 避光孵育10 min， PBS漂洗封片， 荧光显微镜下随机选取高倍视野进行拍照， 激发光波长为365 nm。
1.2.5 RTPCR检测 收集转染后24、 48、 72、 96 h细胞， 各组细胞总RNA按TRIzol试剂说明书提取。将总RNA(0.5 μg)行10 μL反转录体系。取cDNA再进行25 μL PCR反应。PCR循环参数为: 95℃预变性2 min; 94℃变性40 s， 46℃退火40 s， 72℃延伸1 min， 共28个循环(GAPDH: 18个循环)， 于72℃延伸10 min。FAK上游引物: 5′GCGTCTAATCCGACAGCA3′， 下游引物: 5′GCCGACTTCCTTCACCAT3′， 扩增产物为445 bp; 内参GAPDH上游引物: 5′AATCCCATCACCATCTTCCA3′， 下游引物: 5′CCTGCTTCACCACCTTCTTG3′， 扩增产物为580 bp。各取5 μL扩增产物， 经15 g/L琼脂糖凝胶电泳， 凝胶成像仪下观察结果及照相， BandScan 5.0进行条带分析， 检测各组FAK与GAPDH的灰度比值表示FAK mRNA表达水平变化， 比值越高说明目的基因表达越高。
1.2.6 细胞增殖检测 调整细胞密度为6 000个/孔， 接种至96孔板， 设Blank组(只加完全RPMI1640培养液)、 siRNASCR组、 正常对照组、 干扰组(siFAK1、 siFAK2)， 每组每个时间点设6个复孔。培养24 h后弃上清， 进行转染(脂质体: 0.5 μL， DNA: 0.2 μg)。于孵箱中继续培养24、 48、 72、 96 h后每孔加入MTT(1 g/L)15 L， 37℃、 50 mL/L CO2避光孵育5 h， 再加入100 μL DMSO振荡10 min， 酶标仪562 nm处测定各孔A值。生长抑制率=(1-处理组平均A值)/正常对照组平均A值×100%。
1.2.7 细胞迁移检测 于6孔板内按上述方法进行转染， 培养24 h后用外接真空泵的1 mL移液枪头(直径1.5 mm)垂直于6孔板板底分别打孔， PBS清洗2次， 更换完全培养液。分组同1.2.2， 40倍倒置显微镜下照相。于转染后48、 72、 96、 120 h继续照相， Gene Tools软件测定每孔各时间点面积。迁移率=(1-该时间点损伤面积)/原始损伤面积×100%。
1.2.8 免疫细胞化学检测 将细胞接种于铺有无菌盖玻片的6孔板中(1.5×105/孔)， 每组爬片4张。设阴性对照组(PBS代替一抗)、 siRNASCR组、 正常对照组、 siFAK1和siFAK2共5组。转染48 h后取盖玻片用SP试剂盒检测， FAK mAb稀释度为1∶300， 避光条件下， DAB显色， 三蒸水冲洗停显， 梯度酒精脱水， 二甲苯透明， 取出盖玻片置于载玻片上， 胞质出现棕褐色为阳性染色。中性树胶封片后， 每组随机选取10个高倍视野(×200)， 进行图像采集。
1.2.9 统计学分析 数据以x±s表示， 采用SPSS15.0软件进行方差分析。P
2 结果
2.1 重组质粒pU6H1GFP酶切鉴定 用Omega无内毒素质粒小提试剂盒扩增并纯化质粒， 经Hind Ⅲ 酶切鉴定， 可见质粒可被切割成大约5.5 kb的线性片段， 结果完全正确(图1)。
2.2 转染效率 经优化的脂质体条件转染后， GFP表达率为(44.59±2.71)%。
2.3 细胞凋亡的形态学观察 经Hoechst 33258染色可见正常对照组细胞染色质为弥漫均匀的低强度荧光， 无明显凋亡特征(图2A); 经siFAK1和siFAK2组转染细胞48 h后， 细胞表现出典型的凋亡形态学变化， 胞核呈浓染致密的固缩形态、 断裂成块、 呈颗粒状亮蓝色荧光， 且有少量凋亡小体出现(图2D、 E中箭头所示)。脂质体组及siRNASCR组均没有出现明显的凋亡形态学改变(图2B、 C)。因此可得出脂质体试剂及pU6H1GFP载体对转染无明显影响， 排除假阳性的干扰。
2.4 FAK mRNA表达变化 转染Caco2细胞于24、 48、 72、 96 h后检测siRNA敲低FAK mRNA水平表达的时间效应关系， 并确定敲低效果最好的1条序列。RTPCR结果显示， 各组内相应内参GAPDH的条带基本一致， siFAK1和siFAK2组FAK mRNA水平低于正常组和siRNASCR组， 且敲低效应在转染后24～48 h范围内呈时间依赖性降低， 至48 h降到最低(P
2.5 细胞增殖状况 MTT法检测表明， siFAK1和siFAK2组细胞增殖抑制率明显增加(图4)。与正常对照组相比， siFAK1和siFAK2对细胞增殖的抑制率在转染后24～72 h均有统计学意义(P
2.6 细胞迁移状况 与正常组相比， 特异性siFAK1、 siFAK2组使Caco2细胞的迁移率明显降低(P
2.7 FAK蛋白表达变化 免疫细胞化学方法检测结果显示， 正常组FAK表达多位于胞质， 呈棕褐色， 强阳性表达， 而siFAK1、 siFAK2组细胞中FAK蛋白的表达明显减弱(图6)。ImagePro Plus 6.0图像分析各组的A值， 转染后48 h siRNASCR组、 正常对照组、 siFAK1及siFAK2光密度分析结果分别为0.223±0.006、 0.254±0.002、 0.059±0.006、 0.079±0.008。可见转染后48 h两个干扰组的蛋白表达明显被抑制(P
3 讨论
FAK作为Src癌基因的底物， 位于整合素富集的黏着斑处， 与多种信号分子相互作用， 介导多种细胞表面受体激活及信号传输来调控细胞骨架组建、 细胞增殖、 凋亡及存活、 细胞转移及入侵等， 最终参与肿瘤的发生。有研究表明， 在正常结直肠上皮细胞中FAK表达呈弱阳性或阴性[5]， 这与维持上皮细胞的生理功能是不可缺少的; 而在结直肠癌相关的细胞中FAK表达明显升高， 说明其表达上调可能是结直肠癌具有恶性表型的早期事件。因此， FAK作为肿瘤发生进程相关的关键分子可能成为肿瘤治疗的靶点， 而抑制FAK的表达则有望成为肿瘤基因治疗的新热点。针对FAK基因的反义寡核苷酸治疗结直肠癌的研究已有报道[6]。RNAi是近年来快速发展的一种高效的基因沉默技术， 并作为一种关键技术应用于抗肿瘤、 基因功能研究[7]。
本实验以Caco2细胞为研究对象， 采用针对FAK mRNA的特异性siRNA重组表达质粒进行转染。RTPCR显示， 所设计的两个siFAK重组质粒均能使其mRNA水平下降， 其中以siFAK1干扰效果更强， 在转染后48 h敲低效果最明显， 说明siRNA对FAK的抑制作用可能有时相性。而错义组则没有上述作用， 从而另一方面证明RNA干扰的特异性。同时免疫细胞化学检测结果也显示转染后48 h siFAK1对细胞FAK蛋白抑制更明显。
细胞增殖和迁移在多种恶性肿瘤的病理生理过程中起重要作用。有研究表明[8]， 活化的FAKRASMAPK是促进细胞迁移和增殖的重要信号通路。本研究中， 细胞增殖及迁移实验表明， 靶向FAK基因干扰Caco2细胞后， 细胞贴壁能力降低， 变圆易脱落， 细胞的增殖及迁移明显受抑， 因此我们推测FAK基因表达受抑可使FAKRASMAPK信号通路受阻， 最终导致细胞增殖及迁移能力降低， 提示FAK基因可能是结直肠癌肿瘤治疗的一个新靶点。相反siRNASCR组对细胞的增殖及迁移无明显影响， 因此可以断定质粒载体pU6H1GFP可以作为安全有效的基因载体。近年来有关研究表明FAK与肿瘤细胞的凋亡相关。Huang等[9]发现FAK通过活化PI3K/Akt及MAPK/ERK1/2信号存活通路而引发NFκB活化， 最终阻断caspase3级联反应， 使细胞凋亡受抑。因此FAK的表达与凋亡密切相关。本实验初步研究结果显示， 通过Hoechst荧光染色发现siFAK转染Caco2细胞48 h后细胞呈现凋亡的形态学变化: 核致密浓缩， 染色体断裂， 并出现凋亡小体等特征。从分子机制来说， FAKsiRNA可能通过下调FAK mRNA和蛋白表达水平而促使Caco2细胞凋亡。
实验中2个siFAK重组质粒对靶基因的抑制效应不同， 其中以siFAK1抑制FAK基因mRNA、 增殖及迁移的作用最为明显， 这种针对同一基因的不同靶点而产生的不同干扰效果， 可能与位置效应有关[10]。因此说明利用RNA干扰进行肿瘤临床治疗要对干扰序列进行筛选。
综上所述， FAK与肿瘤的发生、 发展密切相关， 我们的初步研究结果表明， 干扰FAK基因表达后使Caco2细胞增殖、 迁移力明显减缓、 细胞出现凋亡等现象， 且FAK基因表达受抑后胞质形态结构受损， 其机制可能与抑制Caco2细胞FAK mRNA和蛋白表达水平有关。因此靶向抑制FAK基因的表达， 可能是结直肠癌治疗的有效途径。此研究为RNAi在肿瘤治疗方面奠定了实验基础， 也为临床研究和进一步的治疗研发提供了更多的依据。
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篇10
甲状腺癌包括分化型甲状腺癌、低分化型甲状腺癌、未分化型甲状腺癌，还有一些少见的恶性肿瘤，如甲状腺淋巴瘤，甲状腺转移癌及甲状腺鳞癌等。1甲状腺癌发病机制研究
随着现代分子生物学技术迅速发展，研究已经证明甲状腺癌发生、发展跟其他肿瘤一样，与癌基因及抑癌基因有密切关系[2]。临床研究还发现甲状腺癌的病变过程与结肠癌的病变过程很相似，两者都经历了多基因参与和多步骤病变过程。甲状腺滤泡细胞在受到射线辐射或者其他因素影响时，RET/PTC、TRK癌基因发生重新排列，此时还不会引发滤泡细胞发生恶性病变，但ras基因在此基础上发生突变就会引发克隆性发展而最终发生恶性病变，形成甲状腺癌[3]。此后，若P53抑癌基因发生缺失甲状腺状癌就会转化为未分化癌，同时伴有DNA甲基化异常、基因表达变化等。
除了上述相关癌基因和抑癌基因的变化之外，某些细胞因子也同样在甲状腺癌变过程中发挥着重要作用，其中值得一提的是VEGF（血管内皮细胞生长因子）家族，VGEF家族史血管生成因子代表，能直接促进血管内皮细胞的生长，增加血管通透性，能为内皮细胞生长和成纤维细胞生长提供基质，从而最终促进肿瘤血管形成[4]。Klein研究发现甲状腺癌组织的VEGF表达明显高于正常人甲状腺组织，且发生转移的甲状腺癌组织的VEGF表达明显高于未转移的甲状腺组织[5]。除此之外，bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）、TGF-β（转化生长因子）等也在甲状腺癌发生和发展中发挥了重要促进作用，这些细胞因子与部分抑癌基因存在相互作用。2甲状腺癌的诊断研究
2.1病史与症状甲状腺癌患者早期无明显症状，病诉以颈部肿块或者结节为主，所以，临床接诊时要对所有年龄段出现的颈部肿块或结节提高警惕[6]。诊断时要仔细了解病史、肿块时间、生长速度、局部症状、全身症状、工作环境、头颈部及上纵膈放射史、性别、家族病史、碘摄入量。除此之外，甲状腺髓样癌肿瘤自身能产生5-羟色胺、肾素、前列腺素等活性物质，临床表现为心悸、腹泻、血钙低、面色潮红等，诊断时需要提高警惕[7]。颈部触诊也可为诊断提供参考依据，甲状腺癌多为单个结节，扪诊肿块形状、大小、硬度、范围、活动度、位置、淋巴结是否肿大等情况。一般癌结节为椭圆形或圆形、质硬、无明显压痛、表面不平，多与周边组织粘连，活动度较差，淋巴结转移的患者还会出现颈部中下和胸锁乳突旁淋巴结肿大[8]。
2.2实验室诊断实验室检查能确诊甲状腺功能情况，协助病情追踪，分析预后。①甲状腺功能检查：检测血清TSH、TT3、FT3、TT4、FT4等，必要时检测TgAb（抗甲状腺球蛋白抗体）、TPOAb（甲状腺过氧化物酶抗体）、TSAb（甲状腺兴奋性抗体）；②Tg（血清甲状腺球蛋白）测定：80%左右的甲状腺癌患者血清Tg异常升高，但要注意部分良性甲状腺疾病患者Tg也会升高，Tg主要用于对甲状腺癌复发判定；③CT（血清降钙素）测定：CT升高是甲状腺髓样癌的特异性标志物，提示肿瘤发生、转移或者复发。对于怀疑为家族性甲状腺髓样癌患者还可分析RET基因突变协助诊断。
2.3影像学诊断影像学检查手段较多，各具优缺点，临床可根据实际情况选择合适的检查手段。颈部超声检查可有效判断甲状腺病变情况，能明确结节数量、范围、大小、结节血供、包膜等情况，近年来B超技术的发展使其在甲状腺癌的诊断中应用广泛。CT扫描也能清楚显示甲状腺病变情况，能通过低密度区显示甲状腺碘含量高低，能提高三维图像显示肿瘤与周边的空间关系。MRI在甲状腺癌诊断中应用较少[9]。核素显像技术能通过特定的显像装置探测到放射性碘元素发出的γ线分布情况，从而获得甲状腺基本情况和核素分布图像。
2.4FNAC（甲状腺细针吸取细胞学诊断）FNAC是一种方便易行、准确性高的检查方法，能准确分辨甲状腺病变的良恶性[10]。FNAC检查在无需麻醉的情况下能反复穿刺，不会引发并发症。3甲状腺癌的治疗研究
3.1手术治疗分化型甲状腺癌患者在无手术禁忌症的情况下应进行手术切除原发病灶，力争根治肿瘤。对大部分患者多选择甲状腺次全切除手术，保留甲状腺旁腺血运及喉返神经。张德恒认为肿瘤直径2cm以下的患者可切除患侧腺叶及峡部，直径2-5cm的应接受次全切除手术，直径在5cm以上、远处转移或两叶多发病灶患者应接受全切除手术[11]。手术治疗的常见并发症是喉返神经受损、喉上神经受损、副神经受损、切口感染等。现在，临床逐渐开始应用内镜手术治疗，它具有微创、无瘢痕、手术视野清晰、术后并发症少等优点。
3.2药物治疗常用的药物有两种：①提取自动物的新鲜甲状腺，作用较好，口服吸收快；②人工合成的左旋甲状腺素钠，主要为T4左旋体，脱碘后形成T3、反T3。治疗时要注意剂量大小，避免大剂量引起甲亢。治疗期间检测TSH浓度，患者耐受情况下可达到理想疗效[12]。
3.3放射性131I治疗手术治疗后131I治疗能除去残余甲状腺组织，是分化型甲状腺癌治疗的有效处理方法。对于术后检查有正常残存甲状腺组织的分化型甲状腺癌或颈部有难以切除病灶或存在远路转移的患者在预期能承受大剂量131I治疗的情况下能进行清甲治疗，肝肾功能异常、哺乳期女性等不适合清甲治疗。同时清甲治疗前要先进行小剂量131I全身影像学检查，估算清除残余甲状腺组织所需的最佳131I剂量，一般选用剂量为2.8-5.5GBq[13]。131I在治疗过程中也会产生一些毒副作用，如消化道不是、颈部水肿、甲状腺炎、一过性唾液腺炎、放射性威严等，一般对症治疗后可缓解。
3.4基因治疗甲状腺癌运用DNA重组技术将患者缺陷基因修复，使细胞功能恢复正常，达到治疗疾病的目的。主要治疗策略包括NIS重新表达、免疫基因治疗、自杀基因导入治疗、抑癌基因导入等。现在，基因治疗仅局限于动物实验和体外培养的细胞。4总结
甲状腺癌是内分泌系统常见的一种肿瘤，其发病因素与射线辐射、碘摄入量以及激素等有关，病变过程中多种基因参与，临床主要检查手段包括实验室血清检测、影像学检查、病理切片等。通常患者需要实施手术治疗，最佳的治疗方案是手术联合术后131I清甲治疗，以期提高疗效，减少复发和死亡率。
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篇11
[中图分类号] R556.6[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2009）01（b）-030－03
The study of mediterranean anemia for screening methods and prevetion and treatment during pregnance
WANG Zhi-hui
(The MCH Hospital of Haizhu District, Guangzhou City, Guangdong Province， Guangzhou510000, China)
[Abstract] Objective: To evaluate the value of the screening methods and the preventions and treatment of mediterranean anemia in pregnant women. Methods: Choosing 700 out-patients from 2005 to 2007 who participated in examination before delivery. Then divided them into three groups refering to the level of Hb. After being given vitamins and folic acid and regulated the food patients take. Checked the biochemiacal exams after 3 weeks. Results: The MCV and MCH in mediterranean anemia group(MA) were significant lower than controlled group and non-MA group (P
[Key words] Mediterranean anemia; Pregnant period; Prevention and treatment
地中海贫血(mediterranean anemia)是一组遗传性溶血性贫血，其共同特点是由于珠蛋白基因的缺陷使血红蛋白中的珠蛋白肽链有一种或几种合成减少或不能合成，导致血红蛋白的组成成分改变[1]。地中海贫血不仅是一种发病率较高的血液系统疾病，而且全球约18亿人为无明显症状的携带者，每年出生100万缺陷患儿，在我国，地中海贫血的高发区位于南方各省份。地中海贫血与妊高征、流产、畸胎及死胎的发生有相关关系，严重影响了优生优育，因此早期预防，及时进行临床干预是非常有必要的[2]。本研究提选择2005年1月～2007年1月在我院妇产科门诊进行常规定期产前检查，首次产前筛查，确诊为地中海贫血的患者病历共700例，进行为期2周的临床干预，现报道如下：
1资料与方法
1.1一般资料
选取2005年1月～2007年1月在我院妇产科门诊进行常规定期产前检查、孕28周前在本院常规产检并住院分娩病例共700例。依据首次产前检查时血常规及血红蛋白结果分为3组：Hb>100 g/L及血红蛋白电泳正常者185例作为对照组；Hb
其中，地贫组240例均嘱男方查血细胞分析及血红蛋白电泳，如双方为同型地贫，则需基因诊断，孕妇α地贫组164例，其中，男方同型4例地贫，2例同为（4，2）型缺失杂合子，（－－/aa），2例同为1基因缺失杂合子，即标准型α地贫。均孕24、28周彩超排除巴氏水肿胎。孕妇β地贫组76例，β及α地贫组2例，男方均无同型地贫，可以排除胎儿重度地贫，不需进一步检查胎儿脐带血。
1.2检测方法
1.2.1血细胞分析用SystemKX-21自动血细胞分析仪(日本产)检测血常规，包括红细胞计数(RBC)、血红蛋白浓度(Hb)、红细胞平均容积(MCV)、红细胞平均血红蛋白量(MCH)、红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)等15项。
1.2.2血红蛋白电泳美国Helena公司的SPLFECOMBO血红蛋白电泳仪，做HbA2定量测定，异常Hb测定、HbF定量测定及不稳定Hb检查。血红蛋白电泳筛查指标：HbA2正常范围为2.5%～3.5%，HbF正常范围为0.5%～2%。
1.2.3基因诊断对筛查阳性的α地贫和β地贫携带者采用地贫诊断基因芯片(Thala Chip)进行地中海贫血的检测，由深圳亚能生物技术公司提供基芯片及技术支持。Thala Chip有24个探针，可同时检测－－SEA、－α3.7、－α4.2 3种常见缺失型α珠蛋白基因和21种β珠蛋白基因的突变。用常规方法提取患者DNA，通过PCR技术和PCR结合反向点杂交（RDB）技术扩增α珠蛋白基因或β珠蛋白基因含突变点DN段，琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。根据DNA标记反应和双链杂交反应的特异性，针对野生型及不同突变型设计特异性杂交探针，然后用特异性荧光染料标记PCR产物。将标记产物和杂交液混合，与玻片上的探针进行杂交，洗涤后用荧光扫描仪扫描玻片，根据杂交结果显示探针的位置及荧光类型判断野生型或不同的突变位点。本研究采用基因诊断确诊为轻型地中海贫血者为地贫组。
1.3临床处理
地贫组孕28周及孕32周予补充叶酸、维生素E、复合维生素B，各2周，并指导孕妇均衡饮食。孕足月入院待产时复查血常规RBC、Hb、MCV、MCH。
1.4统计学分析
将收集到的数据输入计算机建立EXCEL数据库，用SPSS 13.0统计软件进行数据整理和分析。统计方法采用秩和检验和χ2检验。P
2结果
依据首次产前检查时血常规及血红蛋白结果分为3组，孕妇的血细胞分析结果见表1。
表1 各组孕妇的血细胞分析结果比较
表中除对照组和非地贫组的MCH外，各参数在各组间差异均有显著性差异(P
在给予孕28周及孕32周的地贫组予补充叶酸、维生素E、复合维生素B，各2周，并指导孕妇均衡饮食，两周之后再次复查血常规RBC、Hb、MCV、MCH结果见表2。
表2 地贫组予补充叶酸、维生素E、复合维生素B后
与先前的血常规比较
由表2可见，在给予叶酸、维生素E、复合维生素B后，28周及孕32周的地贫组孕在血常规RBC、Hb、MCV、MCH与初检时有统计学差异(P
3讨论
3.1地中海贫血的概况
地中海贫血(mediterranean anemia)也称海洋性贫血（Thalassemia）、珠蛋白合成障碍性贫血、库勒（Cooley）贫血。1925年Thomas Cooley和Pear Lee首次描述这种发生在意大利儿童的遗传性、溶血性贫血病，按受累基因、血红蛋白链位置分为α、β、γ和δ等4种类型，其中以β和α地中海贫血较为常见，广泛发生于热带和亚热带国家，我国以长江以南发病率高，无明显症状的携带者超过人群的20%[3]。
地中海贫血是一组常染色体不完全显性遗传性慢性溶血性疾病，是因珠蛋白基因缺陷使血红蛋白中的珠蛋白肽链有一种或几种合成减少或不能合成，引起血红蛋白的组成成份发生改变而导致的溶血性疾病。
重型地贫胎儿基本不能妊娠至足月，大多在妊娠28～34周胎死宫内、死产或出生后不久夭折，不能长大成人，故临床上成年地贫患者均为轻型，轻型地中海贫血常无临床症状，其外周血中RBC和Hb也可以是正常的[4]。目前，临床上筛查轻型地中海贫血的方法主要有血红蛋白电泳、红细胞脆性检测等。近些年来文献报道轻型地贫患者外周血中RBC、MCV、MCH等血细胞参数发生明显变化，而且有诊断意义[5]。随着临床检验技术的提高，基因诊断的出现很大程度提高了地贫诊断的准确性。
3.2地中海贫血的预防
自20世纪70年代后期以来，在欧洲、中东和地中海的一些地区开展了高危人群地贫的前瞻性筛查，对象主要为育龄妇女及其配偶。Cao等[6]在地中海地区进行了近20年的地贫遗传预防计划，已经取得显著的效果。Hsia等[7]在夏威夷实施了控制地贫计划，包括对高危人群进行筛查、教育公众重视地贫的预防方法、采用最优的筛查策略等。在我国南方，地贫是发病率高、影响较大的疾病之一。如广东的地贫检出率为1.08%～1.16%，广西和海南更高。地贫的预防最关键要从婚检着手。
3.3地中海贫血的治疗
目前地中海贫血还没有很高效的治疗方法，在临床上常用的方法可以分为两大类：药物治疗和基因矫正。药物治疗包括早期的5-氮胞苷、羟基脲和丁酸盐类药物。基因矫正包括补偿策略的珠蛋白基因治疗以及造血干细胞移植治疗。
本研究在临床确诊的基础上，结合患者的初诊的血常规和血红蛋白分析，在孕期通过补充叶酸、维生素E、复合维生素B，各2周。叶酸、维生素E、复合维生素B是骨髓造血与修复所必需的物质，同时指导孕妇均衡饮食，摄入机体必需的微量元素与营养。通过以上的临床干预临床症状得到改善，并且也为优生优育奠定了基础。
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篇12
1 细胞凋亡诱导剂
细胞凋亡是在基因调控下发生的细胞自杀行为。细胞在各种因素如DNA损伤药物、生长因子撤出等作用下，Bcl-2、p53、C-myc、p21等细胞凋亡调控基因的表达发生改变，同时引起一系列生化变化，如胞内Ca2+水平升高，pH值下降，某些蛋白酶活性增高，最终发生细胞凋亡，已有越来越多的证据表明细胞凋亡与肿瘤的发生、发展、治疗及预后密切相关。
Bcl-2的过度表达使肿瘤细胞对一系列细胞毒化疗药物耐受性增加，p53缺失的小鼠对DNA损伤性药物同样表现高度抗性。因此，可以制定一种联合化疗的策略，一种药物抑制细胞凋亡抑制蛋白(Bcl-2，Bcr-Abl)，降低Bcr-abl的表达，使Bcl-2失活，干扰其与Bax的结合，恢复p53功能；另一种细胞毒药物，以远低于通常所用的剂量直接杀伤肿瘤细胞，已得到实验证明是可行的。细胞内Ca2+升高在多种药物诱导的细胞凋亡中有重要作用，因此人为地调节细胞内Ca2+浓度，提高肿瘤细胞对凋亡诱导剂的敏感性，也是一种有效的治疗方法。这一疗法将为治疗非雄激素依赖的前列腺癌展示了美好前景。
2 信号传导阻滞剂
目前，研究肿瘤细胞信号传导机制，选择性阻断肿瘤细胞自分泌或旁分泌的信号传导通路，破坏其自控性生长调节机制，正在成为极具吸引力的研究热点。一方面可以通过阻断生长促进因子或增强生长抑制因子的作用，使肿瘤细胞的生长减慢或停止，另一方面也可以通过促进肿瘤细胞的分化，恢复其正常的生长调节机制而改变其恶性表型。这两方面的作用均可通过选择性地调变肿瘤细胞信号传导系统的不同组分而达到。这与经典的细胞毒性抗癌药物相比，具有选择性强、毒副作用小、不受细胞产生抗药性的影响等优点，尤其对晚期肿瘤或转移癌可能具有独到的疗效，很有希望成为新一代抗癌药物。因此研究肿瘤细胞信号传导机制具有潜在的应用价值和意义。细胞信号传导药物的作用方式可根据不同情况选择：
2．1 多数情况下，正常的细胞信号传导机制在肿瘤细胞中过度活跃，或正常信号分子过度表达。此时可通过部分阻断过度激活的细胞信号传导途径，或抑制过度表达的信号分子的方法，使肿瘤细胞生长速度减慢，直至接近正常细胞水平。
2．2 在某些情况下，肿瘤细胞中的信号分子选择性激活，使得细胞信号传导发生异常。可以利用这个特点，选择性地调变肿瘤细胞中的PKC亚型。许多肿瘤中可见不同的酪氨酸激酶受体的过度表达或过度激活，如上皮细胞肿瘤中常见EGFR家族受体的过度表达，血液细胞肿瘤中常见IGFR家族受体的过度表达，胶质瘤中常见PDGFR家族受体的过度表达等。因此，阻断酪氨酸激酶受体信号转导将抑制肿瘤的生长。
细胞信号传导抑制剂几乎是与基因治疗同步进入肿瘤临床治疗实验的。肿瘤细胞信号传导药物将是抗癌药物研究的一个重要方向。
3 血管生成抑制剂
从癌前病变到侵袭，癌发展阶段伴随着血管生成。目前已经阐明新生血管形成的机制，无疑为抗肿瘤药的发现提供了新的靶点，现已明确至少有12种血管生成促进剂和抑制剂，包括：血管内皮生长因子、FGF、血管生成剂等。这些因子在许多人、鼠肿瘤及正常组织中均有表达；同时，在肿瘤及正常组织中抗血管生成因子也有表达，这表明血管生成的调控有赖于正、负信号的相对平衡，这种平衡的失调便导致新的血管生成。
许多血管生成抑制剂已进入临床试验，包括TNP-470， Marimastat，干扰素(INF)α2a等。其中INFα-2a为第一个应用于临床，用以治疗晚期儿童血管瘤，第二代更为有效的内源性血管生成抑制剂，如Endostatin和可溶性VEGF受体均已进入临床试验。这些效果很好的血管生成抑制剂均需长期服药才能在动物模型上抑制血管生成以引起肿瘤减退，临床疗效有待证实。但无论如何，血管生成抑制剂是抗癌药物研究领域一个颇有前景的发展方向。
4 化疗与放疗保护剂
最新的研究进展表明，p53基因与肿瘤化疗和放疗所引起的副作用有着密切的关系。自1989年以来，人们在越来越多的不同类型的肿瘤中发现了p53基因的突变，其频率可达50-60%，突变的形式可表现为点突变、缺失突变、插入突变、移码突变、基因重排等。存在p53突变的肿瘤包括胃癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、胶质细胞瘤、软组织肉瘤等大多数实体瘤。目前临床上常用的抗肿瘤药如紫杉醇、阿糖胞苷等以及放疗所采用的UV射线、g射线等均被认为是通过诱导p53基因依赖性的细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用。新近研究表明，在小鼠的一些正常组织如淋巴组织、造血器官、肠上皮、等均有p53高表达，而这些组织也正是许多抗肿瘤药物易损伤的部位，也即多数抗肿瘤药产生副作用的敏感器官，如白细胞减少、血小板减少、造血功能降低、胃肠道反应等等。
