医学检验病理方向范文

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[中图分类号]R62 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2014）15-1260-04

Experimental study of transplanted mesenchymal stem cells transfected with adenoviral ventor mediated HGF gene enhance angiogenesis of grain fat grafts

WANG You-hu1，LIU Yi2

（1.Department of Otorhionolaryngology，Nead and Neck Surgery，The First Hospital Lanzhou University，Lanzhou 730000，Gansu，China；2.PLA Center of Plastic Surgery，Lanzhou General Hospital of Lanzhou Command， Lanzhou 730050，Gansu，China）

Abstract： Objective To investigate the angiogenetic effect of transplanting mesenchyma stem cells （MSCs） transfected with HGF gene on fat grafts. Methods MSCs of male Wistar rats were collected and cultured in vitro，and were transfected with Ad - GFP or Ad-HGF.The transfection infectivity of Ad - GFP to MSCs was assayed by fluorescent microsopy and flow cytometry.150rats were randomly divided into 5groups： control group （group A，30rats），MSCs group （group B，30 rats），Ad-HGF group （group C， 30rats），MSCs transplanted with Ad-GFP group（groupD，30rats）， MSCs transplanted with Ad-HGF group（groupE， 30 rats）.Then free fat tissue from inguinal region，mixed with MSCs，Ad-HGF，MSCs transplanted with Ad-GFP and MSCs transplanted with Ad-HGF respective，were transplanted to rats back， but control group were only mixed with DMEM-LG. fat grafts were obtained on day 3，5，7，14，28，60 implantation，The expression of CD34 in fat grafts were detected by immunohistochemistry. Results Transfection efficiency was correlated with the multiplicity of infection （MOI）and a highest transfection efficiency （86.4）could be achieved at MOI of 100.MSC expressed HGF at a high level after being transfected with the Ad-HGF for 48h .The HGF expression could maintain for at least two weeks.Microvesselquantity in group E was much more than that in other group （P

Key words：HGF；MSC；Fat grafts transplant；angiogenesis；gene transfection

Traktueue等[1]预测脂肪移植将来在修复组织缺损中将扮演重要的角色，但是颗粒脂肪移植后存在最大问题是移植脂肪因缺血、缺氧后液化坏死，易被吸收或形成囊肿、纤维化，从而影响远期效果。因此，脂肪移植要取得进一步的进展，就要深入研究脂肪移植后的再血管化[2-3]。

骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类重要的干细胞，可跨胚层分化为各类细胞。其容易分离和培养扩增，同时具有可移植性，易于外源基因转染和表达，是基因治疗理想的载体细胞。肝细胞生长因子（ hepatic growth factor，HGF）是一种多功能的细胞因子，其生物学活性通过单一受体c-Met（c-met protoncogene product） 介导，引起细胞内一系列信号转导途径的级联激活，从而调节细胞的增殖、分化、运动和血管生成等。基于此，我们用腺病毒为载体，把HGF基因导入骨髓间充质干细胞，然后与颗粒脂肪混合移植，充分发挥MSCs多项分化潜能和HGF强大的血管效应，旨在为颗粒脂肪移植建立新生血管诱导生物组织工程模式。

1 材料和方法

1.1实验材料：Ad-GFP（携带绿色荧光蛋白的重组腺病毒）和Ad-HGF（携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒），兰州总医院哈小琴老师惠赠；Percoll试剂（Amersham Pharmacia Biotech公司）；兔抗人CD34多克隆抗体及SP试剂盒（武汉博士德生物工程公司）；DMEM-LG培养基（Gibco公司）；OLYMPUS XT70型荧光倒置显微镜（OLYMPUS公司，日本）；流式细胞仪（BD公司，美国）；Imge-Pro Plus 图像分析软件（Version 4.1）（美国Media Cybernetics公司）。

1.2MSCs的分离、培养与扩增：应用Percoll（1.073g/ml）密度梯度离心法从健康雄性Wistar大鼠（体重120g）的骨髓中分离得到单核细胞，接种于含10%胎牛血清的DMEM-LG培养液中，置于37℃、5%CO2 条件下培养，72h后换液。原代培养6d左右形成细胞克隆，约10天形成贴壁细胞层。胰蛋白酶消化后传代扩增，第3～5代用于实验。

1.3重组腺病毒介导GFP基因/HGF基因转染MSCs：将细胞以1×106 接种于6孔板，贴壁后，弃去培养上清，加入含不同感染强度的Ad-GFP病毒颗粒的DMEM-LG培养基（0、25、50、100、200pfu/ cell）孵育2h，换含5%血清的培养基继续培养48h检测荧光。转染48h后在荧光显微镜下观察绿色荧光强度并用流式细胞仪检测转染效率。Ad-HGF感染采用Ad-GFP转染率最高的病毒强度。

1.4实验动物分组处理及指标检测

1.4.1实验动物分组处理：150只雌性Wistar大鼠（兰州总医院动物实验科提、供）随机分为：空白对照组（A组 n=30）、Ad-HGF组（B组 n=30）MSC组（C组n=30）、Ad-GFP感染MSC组（D组 n=30）、Ad-HGF感染MSC组（E组 n=30）。用3%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（40mg/kg）取腹股沟区脂肪1ml，均匀剪成小块，用生理盐水冲洗。A组 颗粒脂肪1ml+0.4mlDMEM-LG；B组 颗粒脂肪1ml+0.4ml DMEM-LG+1х108pfuAd-HGF液；C组颗粒脂肪1ml+0.4mlDMEM-LG+1×106MSC；D组颗粒脂肪1ml+0.4ml DMEM-LG+1×106MSC（携带GFP基因）；E组颗粒脂肪1ml+0.4mlDME-LG+1×106MSC（携带HGF基因）均匀震动5min，用注射器接12号针头注射于背部的皮肤与肌肉之间。3、5、7、14、28、60天每次各组取5只脱颈处死，并沿被膜分离出移植物，标本用10%富尔马林固定，规制成石蜡切片， HE染色进行组织病理学观察。

1.4.2 血管染色和血管计数方法：按照免疫组化SP法操作步骤进行，工作液浓度为1：150。每张切片分别在周边区和中央区各选3个高倍（×4OO）视野，每个视野中进行微血管计数，然后求其均值。凡是染成棕色单个内皮细胞或内皮细胞簇均作为1个血管计数。

1.5统计学分析：所有数据采用SPSS11.5统计学软件进行处理，数据用均数±标准差（x±s）表示， 并进行单因素方差分析和多个样本均数之间的多重比较，P

2 结果

2.1MSCs 的体外培养：从骨髓中分离获取的单个核细胞培养24h后逐渐出现贴壁细胞，换液逐渐除去未贴壁细胞，培养4天可见似分裂中的成纤维样细胞，6天可见多个细胞克隆形成似，12～14天细胞形态不一、多呈梭形，90%以上融合。传代细胞于24h内贴壁，10～12天融合。

2.2GFP基因/HGF基因在MSC中的高表达：Ad-GFP转染对数生长期MSCs 48h后在荧光显微镜下观察，在低倍的视野下呈“满天星”状，在高倍视野发绿色荧光的MSC，呈不规则形，有些细胞的轮廓清晰可见，有些融合成片（如图1）。当MOI=100时，用FCM检测GFP表达率89.6%，感染效率最高，说明重组腺病毒能够有效的感染MSC。ELISA检测HGF分泌量结果显示，感染MSC后HGF基因可在短期内高效表达，48h表达量最高（如图2）。

2.3 移植颗粒脂肪组织的病理学变化：所有移植体均被纤维被膜包裹。移植后5、7天，E组有大量的血管长入移植物（如图3）。镜下，早期脂肪移植物内及周围有单核细胞、淋巴细胞、浆细胞及中性粒细胞浸润，其中A、B、C、D中央液化坏死明显，只有周边脂肪组织结构完好；而E组坏死较少，且新生血管丰富，有些血管呈垂直状向移植物延伸移植物。移植后26、60天E组包裹纤维被膜厚，而间隔较薄，体积保持明显好于其他4组，细胞分化成熟。

2.4平均微血管密度记数：免疫组化染色后血管呈棕黄色，切片背景清晰，微血管形态不规则，管腔由染成棕黄色的内皮细胞围成（如图4）。腔内可见红细胞，部分血管无明显管腔呈条索状，有的只见到单个或成团的内皮细胞， Ad-HGF转染MSC组7天新生血管达到高峰，14天后趋于稳定。与其他4组相比较，在第3天无差异，但在术后5、7、14、28、60天时均有差异（P

3 讨论

随着目前分子生物学、基因转染等技术的发展，为加速颗粒脂肪移植后血管的重建提供了新的思路。

HGF是一种特异的促内皮细胞生长因子，具有很强促血管内皮细胞有丝分裂、增生，抑制凋亡作用。在兔与小鼠缺血模型中，HGF 能刺激新生血管生成，且不论在体内还是体外试验HGF 的血管生成活性比血管内皮生长因子（VEGF）及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）更为强大[4]。但是，HGF半衰期短，费用高，局部给药困难等缺点而难以推广应用。而我们在HGF基因加速创面血管新生方面已取得了一定的进展[5]。

本实验以腺病毒为介导，将HGF基因导入体外培养的MSCs中，和大鼠自体颗粒脂肪混合移植到其背部，发挥HGF强大的血管作用和MSC多项分化作用，共同协同促进颗粒脂肪移植体的新生血管。实验结果显示，Ad- HGF转染MSC组新生血管生成7天达高峰，提前于其他四组和文献报道[6]的14天，且无论在早期还是长期移植体血管的数量明显多于其他4组（P

MSCs不仅免疫毒性很低，易于外源基因转染和表达等优点，而且移植后可促进新生血管的生成，其途径：①MSC产生VEGF、bFGF、PDGF血管生成素；②能分化成血管内皮细胞和平滑肌细胞[9]。实验结果也显示MSC组的新生血管平均数量多余空白对照组。至于MSC是否像文献报道那样能分化成血管内皮细胞和平滑肌细胞，有待进一证明。

本实验选用腺病毒为载体，该病毒有以下优点：安全、无致畸，致病及致癌性；对分裂细胞及癌细胞株的转染效率达到90%～100%；腺病毒感染细胞时DNA不整合到宿主细胞染色体中；腺病毒容易制备、纯化和浓缩，可达到较高滴度；腺病毒载体插入外原基因的容量较大。实验结果显示通过腺病毒介导，GFP基因/HGF基因成功导入MSCs，并高效表达。

综上所述，骨髓间充质干细胞经转染肝细胞生长因子基因后能持续的表达HGF，从而有效的促进自体颗粒脂肪移植后新生血管的生成，有望提高脂肪移植的远期效果。但是要将基因治疗与干细胞移植真正应用于临床，必须进一步研究这种促血管生物工程模式的安全性、稳定性和可控性。

[参考文献]

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[4]Taniyama Y，Morishita R，Aoki M，et a1. Therapeutic angiogenesis induced by human hepatocyte growth factor gene in rat and rabbit hind limb ischemia models：preclinical study for treatment of peripheral arterial disease[J].Gene Ther，2001，8：181-189.

[5]哈小琴，李元敏，毕建进，等.肝细胞生长因子基因转染促进伤口愈合及预防瘢痕形成的实验研究 [J].中华创伤杂志，2003，19（12）：752-753.

[6]Langer S，Sinitsina I，Biberthaler P，et al .Revascularization of transplanted adipose tissue ： astudy in the dorsal skin fold chamber of hamsters[J].Ann Plast Surg，2002 ，48：53259.

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[8]Morishita R.Recent progress in gene therapy for cardiovascular disease[J].Circ ，2002，66（9）：1077-1086.

篇2

韶关学院医学院座落在广东省粤北山区，我校医学检验技术本科班招生始于2007年，专科班招生始于2002年。一直以来我们的培养目标非常明确，也一直把立足粤北，面向广东，服务各级医院的理念，融入到人才培养方案和课程教学中。目前医学检验技术发展迅速，我们也应该认清当前专业发展趋势，采取有效的措施促进本校医学检验技术人才的培养，使我们培养出来的检验技术人才能够迅速适应社会的要求，为此我们对2014届、2015届及2016届医学检验技术本、专科学生的就业率及就业方向进行了统计分析，来为医学检验专业的建设提供理论依据。

一、医学检验技术本、专科就业情况分析

我校2014届、2015届及2016届医学检验技术本科班学生共141人、专科学生共125人。现对本、专科就业情况进行如下统计分析：注：镇级、社区、县级、地市级分别指相应级别医疗卫生机构，企业包括独立检验机构及其它公司。从就业情况可看出：医学检验本、专科的就业情况还是很不错的，如就业率高达95%以上、专业对口率也达88%以上,本、专科相差不大，但是收入方便，据调查本、专科稍有差距（本科人均3240元、专科人均2650元），虽然与学生期望值有点距离，但任何医院检验科的奖金收入都是比较高的，就业转正以后情况就会好起来的。从就业方向可看出：检验本科的就业方向主要是地市级、县级医院检验科；检验专科的就业方向主要是乡镇、社区医院检验科及独立检验机构（如广州金域检验中心），这说明学生的就业面广，就业方向稳定，就业前途理想，基本上能做到专业对口，学以致用，从事本专业工作。

二、加强医学检验专业建设

由上述数据可以看出医学检验本、专科的就业情况良好，但是如何加快培养适合临床医学发展需要的医学检验应用型人才，是摆在我们面前的艰巨任务。因此，我们要以学生就业为导向，以能力为本位，以培养应用型高技能人才为目标[1]，明确专业建设目标定位，坚持以教学为中心，以教学基本建设为重点，以教学改革为动力，加快学科建设步伐，从区域经济社会发展和卫生服务需求出发，立足粤北、面向全省，服务各级医院，培养具有创新精神，实践能力强，综合素质高的应用型医学检验专业人才，打造粤北地区医学检验专业人才培养的重要基地。为达到上述办学目标，促进学科建设我们采取了一些有效措施：首先我校医学检验本、专科专业课积极开展教学改革，在满足医学检验专业一般性实验教学的基础上，专业老师可根据实验室的仪器设备，从专业培训的综合要求出发，对原有的实验内容进行筛选、补充、综合，减少验证性实验，增设一些综合性、设计性的实验内容，培养学生获取新知识的能力；其次结合临床实际，医学检验专业学生在学校的临床检验中心可通过实验室开放或者见习的方式，熟悉或掌握医院检验科的规章制度，掌握各种仪器的操作流程，日常维护等方面的专业知识；另外，我们决定在条件成熟的基础上开设专科层次的病理检验技术方向和输血检验技术方向，病理检验技术方向主要是在临床医院病理科做技术员，输血检验技术方向主要是在医院血库及各级血站检验科工作，这样既顺应了临床医疗工作发展的需要，也可以更好地拓宽学生的就业渠道。总之，为了加强医学检验专业的建设，提高学生的就业率，改善学生的就业环境，我们仍然需要更多的努力和付出，同时也希望我们所采取的上述措施可以为其他院校检验专业的建设提供参考。

篇3

血液病理学是对血液学检验的重要补充医学检验专业设置的涉及血液病诊断的课程主要有病理学和血液学检验。在病理学中，血液系统疾病一般设置2学时左右，没有安排相关的实验教学学时，这对分类复杂的骨髓肿瘤及淋巴瘤的诊断显然是不够的；血液学检验虽然有大量的涉及血液病诊断的骨髓形态学知识，但一般集中在细胞学水平，对组织学形态特点一般设为自学内容；对淋巴组织肿瘤的学习一般安排0～4学时不等，但没有相关的实验教学学时。这是因为这两门课程内容多，课时少，在有限的授课时间内难以将与血液病相关的技术和研究热点传授给学生。因此，开设《血液病理学》介绍各种贫血及恶性血液肿瘤的淋巴及骨髓组织学特点、免疫表型及基因诊断等热门的专题内容是非常必要的，是对血液学检验的重要补充。

2医学检验专业开设血液病理学的教学实践

2．1开课时间大连医科大学于2003年设立了医学检验（临床血液检验专业方向），血液病理学为其必修考试课。学生完成课程到医院实习后，临床医生反映学生对血液病知识掌握较好。2010年大连医科大学进行教学大纲修改，经专家认证批准后在医学检验专业增开血液病理学，课程类型为考查课，开课时间为第七学期（实习前的最后一学期），应落后于血液学检验开课时间，此时学生已对血液疾病有了很好的概念。血液病理学教材为自编讲义，共设48学时，其中理论课24学时，实验课24学时。

篇4

汝昆是血液病医院病理中心的主任。他毕业于山东医科大学，在中国协和医科大学获得生物化学和分子生物学硕士学位。他在纽约州立大学（State University of New York at Buffalo）获得博士学位以后，在新英格兰医学中心完成了解剖病理和临床病理的住院医生培训， 并在宾州大学接受了血液病理的专科训练。2012年回国之前，他曾在美国匹兹堡Allegheny General Hospital担任了五年血液病理科主任。

病理科的发展情况是怎样的？国内外有何不同？病理科对信息化有哪些要求？6月20日，记者对汝昆进行了采访。

诊断科室应获得更多尊重

汝昆对目前病理、检验、放射科室“功能科室”或“辅助科室”的定位有着不同看法，他觉得诊断作为治疗的基础和支撑，应该是和临床治疗具有同等重要地位的。汝昆所在的血液病医院的病理中心以患者为中心，整合了检验、病理的资源和建制，这种模式在欧美发达国家已经成为常态和共识，他希望中国也能借鉴欧美模式，成立综合性的诊断科室，并提升其地位。

请您简单介绍一下病理中心的情况。

汝昆：我们医院的病理中心是国内唯一一家做血液病理的专门科室。相对其他临床科室来说，血液病对实验室的依赖性非常强，没有诊断几乎不能开展治疗。由于各种历史原因，中国实际上不存在血液病理这一专科，血液病的诊断是分散在几个不同的科室的，包括病理科、检验科和血液学实验室。另外，有的医院现在还有单独的中心实验室或分子生物学实验室，分布在三四个不同的部门里。

我们科室目前是按照“大病理”的模式建设的，也就是说检验、病理统一在一起。我刚回国的时候，我们这个中心还处于一种松散的状态，形态学、流式细胞学、遗传学、分子生物学……各个实验室虽然存在，但是各自为政。我从国外回来之后的首要任务就是着手进行血液病理的学科建设，把几个亚专科整合在一起，不光从行政上作为一个中心，而且更多地体现在质控体系和报告上，把一个患者原本应该放在一起的信息整合成一份综合的诊断报告。经过一年多的努力和准备，我们中心在去年底先后通过了ISO15189（2007医学实验室质量和能力的专用要求，由国际标准化组织ISOTC212临床实验室检验及体外诊断检测系统技术委员会起草，编者注）和CAP的实验室认证（由美国病理家协会负责的医学实验室的认证，编者注），我们是国内三甲医院中第一家同时通过两个认证的临床诊断科室。

请您结合血液病理专业谈一谈国内外病理医学的异同，以及病理医学的发展历程和趋势。

汝昆：在美国，既没有单独的病理科，也没有单独的检验科，而是统称为病理和实验室医学科，实际就是病理和检验专业完全整合在一起的一个科室。我认为这种模式无论是管理、利用效率还是诊断的准确性都会更好一些，因为各种资源都能协调起来。

在医学里，诊断和治疗是同等重要的。但是在国内往往把病理科、放射科等学科称为“辅助科室”或者“医技科室”，我不知道这种归类或命名是谁规定的，但毫无疑问是外行干涉内行的一个典型例子，因为诊断的重要性无论怎么强调都不过分，没有一个准确的诊断就不可能进行治疗。

从另一个角度讲，虽然这几年国内对诊断行业的投入有所增加，但是跟发病率的增长、经济的增长以及新的治疗技术、诊断技术的发展还很不匹配。一般来说，诊断费用不会超过患者整个费用的十分之一，而在中国可能连二十分之一都不到，从这个角度来说，对于很多患者尤其是初诊的患者，一定要有一个全面的诊断，尤其是随着靶向药物、个性化医疗的发展，其对患者的治疗有着很重要的价值。这些数据不光是给患者的治疗提供了循证医学的依据，同时也为基础研究提供了一些很有价值的数据。

我认为对检验也好、病理也好，更合适的名称应该是诊断科室，其最终目的是给临床医生提供一个准确可靠的诊断，从而造福于患者，如果没有这层基础，其他都是空中楼阁，无从谈起。

检验、病理等科室合并为诊断科室，您觉得这会是一个趋势吗？

汝昆：我个人希望是一种趋势，目前无论是在美国，还是在欧洲国家，这都已经成为了一种常态，这无论对医生的诊断，还是对患者的治疗都是一件好事情。但是好事情如果不推动，一样得不到发展。这需要医学行政领导和专业领导有高屋建瓴的、开放的姿态，放弃小利益，推动整个医学模式的革新和发展。但是从现实情况来看，政府更关心的可能是医疗费用、医患关系、医保、药物这些内容，检验、病理短期内未必能提上卫生行政部门的议程。

信息化成了病理发展的瓶颈

汝昆对病理科目前正在使用的信息系统颇为不满，有很多基本的功能，如关键字检索都还没有实现。他说，现在国内还没有把检验和病理系统整合在一起的软件系统，希望有企业在这方面有所介入，应该会有很好的市场前景。

医学的发展对病理医学提出了更高的要求，病理技术本身也在发展，这对信息有哪些要求？

汝昆：病理系统中，录入录出系统、跟仪器的直接接口、报告之间的互相交叉引用等功能都是应该具备的，报告间的互相交叉引用这块国内做得很差，还有一些简单的编辑功能、图像功能也应该具备。另外一些内容，比如说合不合法规，医保可不可以报销，由于各地物价不同，系统是否可以根据各个地区自动调整版本，这些也很重要，可能是医院领导、行政部门更关心的。

病理信息化是制约国内病理医学发展的环节之一，国内有几家检验系统和病理系统的厂家，但是他们都有很多明显的缺陷，目前国内还没有一家公司能够把两个系统整合起来。