生物细胞的功能范文

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篇1

中图分类号：TU655 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）24-0217-01

介绍

中性粒细胞又称中性多形核白细胞（PMN）是人体重要的免疫细胞之一，近年来对其功能的认识被不断更新.除病原体杀伤与吞噬功能之外，PMN在免疫调节、炎症消退中的作用愈发受到关注.PMN平衡是涉及到活化、募集、趋化、凋亡和胞葬等一系列过程的复杂机制，由多种细胞和细胞因子调节，是免疫防御的基础，对机体有重要意义。免疫系统的生理功能是保护宿主免受感染性微生物。防御微生物是由先天免疫的早期反应和随后的适应性免疫与不同的细胞类型和分子介导的。在一些情况下，该过程还可损伤组织并引起疾病。多形核嗜中性粒细胞是招募到微生物感染和炎症反应的位置的最早的免疫细胞之一[1]。它们是人类血液中最丰富的免疫细胞群体。疾病如中性粒细胞减少或嗜中性粒细胞功能紊乱显示它们对于控制细菌和真菌感染是必需的[2]。中性粒细胞在骨髓中从常见的骨髓祖细胞发展。粒细胞集落刺激因子（G-CSF）是调节嗜中性粒细胞增殖，分化和动员的主要因子。最近的研究表明，在稳态条件下，小鼠循环中性粒细胞的寿命为12.5小时，人嗜中性粒细胞寿命为5天[3]。在感染期间，嗜中性粒细胞通过激活增加其寿命7倍[4]。

中性脂肪的塑性和分布

中性粒细胞和1型促炎过程之间的强联系已被长期认识。最近的观察显示嗜中性粒细胞与2型免疫的密切关联可能揭示我们对嗜中性粒细胞的全部能力的无知，超过了它们在炎症性组织损伤和对细菌感染的保护作用的众所周知的作用。 最近的研究表明嗜中性粒细胞表现出相当大的可塑性。这些嗜中性粒细胞亚群的动态变化发生与癌症和炎症的疾病进程分辨率。HDNs向LDN的转移仅在来自癌症晚期的小鼠的血液中是明显的，这表明其可以通过与晚期疾病相关的细胞因子/趋化因子环境的变化介导。最近，在心肌缺血 - 再灌注损伤模型中的心肌梗塞后5天和7天发现嗜中性粒细胞的抗炎亚组，与其在循环中的促炎相应物相反。 随着从心肌梗死后第1天到第7天的修复过程，这些细胞的数量逐渐增加。应当注意，嗜中性粒细胞携带许多功能性细胞因子受体。细胞因子受体的多种表达支持特定细胞因子环境的嗜中性粒细胞极化的概念，这需要在将来解决。综合起来，这些研究强烈支持嗜中性粒细胞功能可塑性和极化的存在，证明诱导因子，调节分子网络，表型特征和差异极化嗜中性粒细胞的生物学意义。我们相信相关研究可能提供新的见解中性粒细胞对炎症和免疫疾病引起的发病机制的贡献，并可能提供治疗中性粒细胞相关疾病的新治疗方法。

嗜中性粒细胞释放的细胞因子和化学成分

除了参与初级防御感染，中性粒细胞产生和释放大量的细胞因子和趋化因子组成型或在微环境刺激，应当注意，尽管两个物种之间基因组基本保守，但是人和小鼠之间存在嗜中性粒细胞的细胞因子和趋化因子产生的一些差异。有趣的是，嗜中性粒细胞组成性地储存一些细胞因子和趋化因子，如BAFF，TNF相关的细胞凋亡诱导配体（TRAIL），CXCL8，CCL20和IL-1R拮抗剂（IL-1Ra）在细胞内库中的显著量。体内和体外实验已经显示小鼠中性粒细胞分泌大量的IFN-γ以应答病原体，如类诺卡氏菌和单核细胞增生利斯特氏菌。嗜中性粒细胞中细胞因子和趋化因子mRNA表达的失调导致许多免疫相关疾病。因此，活化的嗜中性粒细胞在精细控制下释放需要强调的大量细胞因子。

通过细胞因子和化学家的嗜中性粒细胞的生理学角度分析

中性粒细胞可通过一系列细胞因子和细胞表面分子与许多其它免疫细胞（如DC，巨噬细胞，NK细胞和淋巴细胞）建立串扰。中性粒细胞可以通过乳铁蛋白，α-防御素和趋化因子（如CCL3）产生和直接细胞相互作用来募集DC并促进后来的成熟。 在IFN-γ刺激后，嗜中性粒细胞表达低水平的MHC II和共刺激分子，其可以促进T细胞活化，Th1和Th17细胞分化，并将抗原递送至DC。作为被招募到流感感染的气管中的最早的免疫细胞之一，嗜中性粒细胞留下富集趋化因子CXCL12的长期痕迹，其负责将活化的效应T细胞导向感染部位。炎性粘膜中浸润的嗜中性粒细胞可代表重要的起始信号或通过多种途径的炎症消退的关键决定因素。在炎症的解决阶段期间，巨噬细胞摄取凋亡嗜中性粒细胞导致巨噬细胞的IL-23产生减少，这减少了T细胞的IL-17分泌，因此减少了G-CSF产生和嗜中性粒细胞分化。巨噬细胞对凋亡嗜中性粒细胞的吞噬刺激巨噬细胞是M2样表型，产生更多的IL-10和更少的IL-12以促进炎症消退期间的组织修复。

细胞因子/趋化因子介导的中性粒细胞在疾病中的作用

嗜中性粒细胞通过多种途径以正性或负性方式高度参与许多疾病的发病机理，例如感染，自身免疫疾病，肿瘤和移植排斥。在发病过程中由活化的嗜中性粒细胞释放的细胞因子和趋化因子的作用在下面部分中简要总结，最近的研究表明，人嗜中性粒细胞具有允许识别外来和潜在危险的RNA和DNA的细胞内传感器系统。因此，嗜中性粒细胞可能具有通过细胞因子和趋化因子释放在对细胞外和细胞内微生物的免疫前线作用的潜在能力。在病毒感染期间，迁移的嗜中性粒细胞留下富含趋化因子CXCL12的长期痕迹对于病毒特异性CD8 + T细胞募集和效应子功能是关键的。TAN在癌症的建立，进展和转移中的重要性日益受到重视。积累的研究揭示中性粒细胞在肿瘤生物学中的双重作用。TAN可以在某些情况下促进恶性肿瘤，例如通过释放生长刺激信号，基质降解蛋白酶以及血管生成的介质。嗜中性粒细胞的渗透见于更具攻击性的肿瘤类型如胰腺腺癌，但高中性粒细胞计数与胃癌患者的良好预后相关。

结论

中性粒细胞可以在不同的微环境下差异性地切换表型并显示不同的亚群，例如N1和N2嗜中性粒细胞。中性粒细胞可以组成型或在微环境刺激时产生多种细胞因子和趋化因子。此外，嗜中性粒细胞可以直接与DC，巨噬细胞，天然杀伤细胞，T细胞和B细胞相互作用，以便加强或下调先天免疫和适应性免疫。证明诱导因子，调节分子网络，表型特征和差异极化嗜中性粒细胞的生物学意义。我们相信有关的研究可能提供新的见解中性粒细胞对炎症和免疫疾病引起的发病机制的贡献。了解中性粒细胞在病理情况下的功能可塑性和免疫力的调节能力可能为未来在临床中治疗相关疾病提供新的治疗方法。

参考文献：

[1].Mantovani， A.， et al. 2011. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity.？Nature Reviews Immunology 11（8）： 519-531.Google Scholar.

篇2

【关键词】 牛膝;多糖;衍生物;糖尿病;胰岛细胞;肾功能;大鼠

Abstract: ? Objective: To study the effects of Achyranthes bidentata polysaccharides (AbP) and the sulfated derivative (S-AbP) and the phosphorylated derivative?(P-AbP)?of AbP on the morphology of islet cells and renal function in diabetic rats. Methods:?Diabetes was induced by a single injection of streptozotocin， changes of fasting blood glucose and morphology and secretion of islet cells in diabetic rats treated respectively with S-AbP，P-AbP and AbP were observed，the renal function was also evaluated by examining serum creatinine (Scr) and blood urea nitrogen (BUN). Results:?Compared with diabetes group， the blood glucose significantly decreased in S-AbP， P-AbP and AbP treated group(P?

Key words: ?Achyranthes bidentata Blurne;Polysaccharides;derivative;diabetes;islet cells;renal function;rats

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一组由胰岛素分泌缺陷或生物学作用障碍引起的以高血糖为主要特征的常见内分泌代谢疾病。DM并发症累及多器官系统的功能损害。进行性胰岛β细胞毁损，胰岛素分泌缺乏是1型DM的主要病理生理特征，也是其发生发展的驱动因素[1]。我们以往的研究已经证实牛膝多糖(Abp)衍生物对DM大鼠肝、肾氧化应激损伤有明显的保护作用，对DM大鼠的高血糖、高血脂状态具有一定改善和控制作用[2-3]。本实验拟通过观察Abp及其衍生物对链脲佐菌素诱导的DM大鼠胰岛细胞形态结构、血清肌酐和尿素氮含量等的影响，旨在探讨其对DM大鼠胰岛β细胞、肾功能损伤的保护作用及其可能机制。

1??材料和方法

1.1??实验动物??清洁级(II级)雄性SD大鼠，体重200～250 g，由温州医学院实验动物中心提供，实验动物许可证号sysxk(浙)2005-0061。

1.2??主要药品与试剂??AbP中科院上海有机化学研究所，纯度：99.8%);牛膝多糖硫酸酯(S-AbP，本实验室参考田庚元[4]的方法，采用氯磺酸-吡啶法自制，多糖酯含量91.3%，取代度2.39);牛膝多糖磷酸酯(P-AbP，本实验室参考田庚元[5]的方法，以三氯氧磷为磷酸化试剂自制，多糖酯含量86.5%，取代度0.70);链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)由Sigma公司出品，临用前以无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制成pH 4.2、浓度为2.5 mg·mL-1的工作液;消渴丸，广州中一药业有限公司(批号为J00387);HE染液(南京建成生物工程公司);兔抗鼠胰岛素抗体(北京博奥森生物技术有限公司);山羊抗兔IgG抗体，DAB显色试剂盒(北京天来生物公司);其他均为国产分析纯。

1.3??动物模型制备、分组与给药??SD大鼠适应性喂养1周后，随机取出6只作为正常对照(NC)组，除NC组外，其余的大鼠禁食12 h后，按55 mg·kg-1剂量一次性腹腔注射新配制的STZ，NC组给予0.1 mol·L-1 pH 4.2柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液腹腔注射。注射后72 h，尾部采血测空腹12 h的血糖，把血糖值高于16.8 mmol·L-1并稳定1周的大鼠定为DM大鼠。将DM大鼠随机分为5组，每组6只动物，即模型DM组、消渴丸(XK)组、S-AbP组、P-AbP组及AbP组。NC组和DM组按0.1 mL·kg-1灌胃蒸馏水，XK组按1.5 g·kg-1灌胃消渴丸，S-AbP组、P-AbP组和AbP组分别按100 mg·kg-1灌胃S-AbP、P-AbP和AbP，每天灌胃1次，并且每隔2 d 称体重1次，及时调整灌胃剂量。各组大鼠在室温24～26 ℃下用同种饲料饲养，持续灌胃30 d后处死。

1.4??血糖、血清肌酐(SCr)和尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)含量测定??大鼠禁食12 h后乙醚麻醉，眼眶后静脉丛取血， 37 ℃温浴10 min，以3?000 r/min速度离心10 min，取上清500μL，用日立7170全自动生化分析仪测定血糖、Scr和BUN水平。

1.5??胰腺组织HE染色??大鼠处死后立即取胰腺组织，放入新鲜配制并4 ℃预冷的4%多聚甲醛内固定24 h，常规脱水，透明，石蜡包埋制成石蜡切片，HE染色，光镜观察。

1.6??胰腺组织免疫组化染色??免疫组化染色按SP试剂盒说明进行操作，DAB染色，苏木素复染，脱水，透明，封片，显微镜观察，拍照。

1.7??统计学处理方法??以one-way ANOVA分析各组别之间的差异，各组间均数比较采用LSD检验。

2??结果

2.1??S-AbP和P-AbP对糖尿病大鼠血糖水平的影响

??药物治疗前，DM组和各治疗组间大鼠血糖浓度差异无显著性，但均明显高于NC组(均P?

2.2??S-AbP和P-AbP对糖尿病大鼠Scr和BUN水平的影响??DM组大鼠Scr和BUN水平显著高于NC组(P

2.3??S-AbP和P-AbP对糖尿病大鼠胰岛病理形态学的影响??见图2，NC组大鼠胰岛数目较多，呈现圆形或椭圆形细胞团状，边界清楚;胰岛内细胞数目较多，排列整齐，胞浆丰满，核多为圆形。DM组大鼠胰岛数目稀少，胰岛内细胞排列不规则，边界不清，胰岛细胞核大小、形态不规则，部分胰岛细胞发生空泡变性，也有淋巴细胞浸润现象。XK组和S-AbP组与DM组相比病变较轻，胰岛内细胞数目增多，分布规则，胞浆饱满，细胞核大小形态接近正常。P-AbP组和AbP组的胰岛病变也较DM组轻。

2.4??S-AbP和P-AbP对DM大鼠胰岛素表达的影响??胰岛β细胞分泌的胰岛素与其特异性的抗体结合后呈现棕褐色颗粒。NC组大鼠胰岛内充满β细胞(胰岛素阳性反应细胞)，分泌颗粒丰富(棕褐色)，着色深。DM组大鼠胰岛内β细胞分布稀少，分泌颗粒较少，着色较浅。XK组和S-AbP组大鼠与DM组大鼠相比胰岛素阳性反应细胞较多，分泌颗粒较多，着色较深。P-AbP组和AbP组大鼠也有少数着色较深的分泌颗粒，见图3。

3??讨论

STZ是一种广谱抗生素，具有抗菌、抗肿瘤的性能和致DM的作用，对实验动物的胰岛β细胞具有高度选择性的毒性作用，引起胰岛素分泌绝对不足。STZ诱导的DM与人类1型DM的临床表现、过程及胰岛的改变等方面有许多相似之处。此模型具有制造方法简便、药物毒性较低、胰岛β细胞损伤特异性高等优点，是目前国内外研究1型DM较理想的动物模型[6]。在本实验中，大鼠经用STZ腹腔注射后，血糖显著升高，而胰腺病理学检查显示胰岛数目减少，β细胞分泌颗粒减少，即胰岛素合成分泌不足，从而诱发大鼠致1型DM。

AbP是从牛膝中提取的一种小分子水溶性多糖，具有降血糖、免疫调节和活血化瘀等功能[7]。多糖衍生化是提高多糖活性的重要手段，一些本来无活性的多糖经过衍生化后活性可大大改善。硫酸酯化和磷酸酯化是多糖的重要衍生化方法[8]。本实验显示，DM大鼠予以S-AbP、P-AbP和AbP治疗后，血糖明显降低，胰岛β细胞数量增加，增生肥大的β细胞容积基本恢复正常，胰岛素分泌功能显著改善，表明S-AbP、P-AbP和AbP对DM大鼠胰岛β细胞具有一定的保护和修复作用。本实验同时发现S-AbP、P-AbP对DM大鼠胰岛β细胞的保护作用优于AbP，这可能是AbP经硫酸化或磷酸化修饰后，构象改变，抗氧化、清除自由基等能力增加，显示出更高的生物学活性或新的生理活性[2，9]，因而对胰岛β细胞起到更好的保护作用。

DM大鼠血糖长期居高不下，会导致肾脏出现肾小球增生肥大、基底膜增厚等病理改变，继而影响肾功能。我们的研究表明S-AbP、P-AbP和AbP能在一定程度上减轻DM大鼠肾脏的病变程度(已于另文报道)。Scr和BUN是反映机体肾功能的重要指标，本研究发现DM大鼠Scr、BUN含量升高，P-AbP、AbP使DM大鼠Scr含量明显降低，S-AbP使DM大鼠Scr、BUN水平都显著降低，表明S-AbP和P-AbP、AbP对DM大鼠肾功能有一定的保护作用。

总之，本实验从生化、胰岛细胞形态学角度证实，S-AbP、P-AbP和AbP可改善DM大鼠高血糖状态，保护肾功能，对胰岛β细胞功能具有一定的保护作用，且S-AbP和P-AbP的作用优于AbP。AbP具有抗氧化[2]、调节机体免疫[10]、降血脂[3]等作用，而且较之灵芝多糖、香菇多糖等，AbP具有相对分子质量小，水溶性好，药源广泛，使用方便(既可口服，又可注射)等优点。因此，作为一类新型的降糖药物，AbP尤其是其衍生物，具有广阔的医药开发和应用前景。

参考文献

[1] 杨钢. 内分泌生理与病理生理学[M].天津:天津科学技术出版社，2000:416.

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[3] 薛胜霞，金丽琴，贾东明，等.牛膝多糖衍生物对糖尿病大鼠血糖血脂的影响[J].中国药学杂志，2009，44(2):107-110.

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[5] Chen XM， Zhang J， Tian GY. Studies on synthesis and anti-tumor activity of phosphorylated achy-ranthes bident-atapolysaccharide(P-AbP)[J].Chin J Chem， 2002， 20(11):1406-1410.

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[7] 李海泉.牛膝多糖降糖作用实验研究[J].安徽医药，2004，8 (5):326-327.

篇3

前言

光合菌、酵母菌、益生菌等多种微生物均为有益微生物，结合发酵工程技术，将其应用在食品生产中，能够为人类提供多种口感特别、营养且具有不同保健功能的食品，不仅可以促进生产工业的发展，也为丰富人们的饮食与提升生活质量作出了重要贡献[1]。

1 微生物发酵食品的优点

相关研究显示，采用微生物工程发酵技术生产的发酵食品具有多种优点，可以提升普通食品的营养价值和保健功能[2]。第一，部分微生物可合成维生素B，而后者为人体所需的微量元素，食物经过发酵后维生素B含量会明显增加，比如常见的酸奶、牛奶等。第二，发酵技术可使微生物分泌植酸酶物质，可将豆类食品中的植酸以及其他矿物质转化成生物活性形式，提高铬、锌、铁及钙等微量元素的保留率和利用率。第三，利用微生物发酵技术可增强食物蛋白质的可吸收消化率，提高食物的营养价值。第四，发酵技术能使微生物中的活性因子最大限度地分解出来，使食物吸收率进一步提高。第五，普通食品在经过微生物发酵后有益菌的含量会明显增加，而后者可抑制人体有害菌的生成，改善肠道功能。第六，部分微生物发酵食品还具有抗癌、抗衰老、降血压等功效，如酸奶、醋等。

2 各类常见发酵食品及其营养和保健功能

2.1 发酵乳制品

乳酸菌是一种对人体肠道有积极作用的有益菌，发酵乳制品是以乳液作原料，采用发酵技术制成的，具有适口性好、易消化、营养丰富以及易保藏等多个优点。参与乳制品发酵的微生物除了乳酸细菌之外，还有霉菌和酵母菌等，比如沙门柏干酪与蓝色干酪等酸奶油就又沙门柏青梅、娄地青霉等参与发酵。发酵乳豆制品、酸豆奶、酸奶等发酵乳制品均富含乳酸菌成分，食用后可增加体内乳酸菌，并对有害菌有良好的抑制作用，因此对人体有益，是一种营养价值高、口感独特、价格实惠的食品[3]。除了可调节肠道功能之外，发酵乳制品还可改善肝脏功能、降脂、预防便秘、增强免疫力，经常食用还可改善精神衰弱、入睡艰难的精神症状。

2.2 发酵豆制品

大豆的蛋白质成分含油量高达40.00%，还含有铁、钙、核黄酸、硫胺素、氨基酸等多种人体所需的多种元素，豆奶、豆乳等豆类发酵食品均是以大豆作原料，并利用微生物发酵技术使大豆发酵制作而成。在发酵的过程中，大豆含有的部分蛋白质物质受到微生物蛋白酶作用而发生分解，从而增加发酵品的水溶性氮，软化大豆，既可以将食物原有的活性成分最大限度地保留下来，又可以将豆类自身的腥味、胀气因子等分解掉，因此不仅营养美味，发酵后的豆类所游离出的核黄素、谷氨酸等成分还具有提高记忆功能、抗衰老等功效。发酵豆乳具有调节血脂、降血压的保健功能，因为发酵豆乳中含有豆固醇，且富含大豆异黄酮类成分，而不含胆固醇，另外还含有γ-氨基丁酸和ACE抑制肽等可降血压的成分，因此可以很好地调节血清胆固醇、改善血压，预防动脉硬化、脑溢血等心血管疾病。

2.3 面类发酵食品

馒头、面包类食物是全国各地人们喜食的食物之一，尤其在以面食为主食的北方地区。馒头、面包的制作主要是利用酵母菌使面粉发酵，再通过合理的原料配比和蒸煮而成，口感好且易于保存与携带[4]。除此之外，馒头、面包也具有丰富的营养和良好的保健功能，例如胚芽面包有利于肠胃功能的修复，糙米面包有利于心脏病、糖尿病以及肥胖症等病人病情的改善，因为微生物发酵食品经过发酵会将自身的部分碳水化合物消耗掉，这样食品所含能量也会减少，因此有助于减肥，如果在面包中国加入藻类，还可促进血循环。酵母的抗氧能力很强，对肝脏有良好的保护作用，还含有铬、硒等具有抗肿瘤、抗衰老的矿物质，面类食品经发酵后可分解植酸，从而增加铁、镁、钙等元素的可吸收性，增强人体免疫功能。

2.4 发酵风味调味品

风味调味品使人们的饮食更加的多样化，利用发酵技术生产风味调味品可以最大限度不留食物原有的生物类黄酮、膳食纤维、多糖等有益活性成分，同时还可分解掉低聚糖、豆腥味、胀气因子等对人体不利的成分。比如豆瓣酱、美容醋、保健酱油、腐乳、纳豆、黄酱、豆豉等，既开胃、易于消化，又具有抗衰老、增强记忆、抗血栓等功效。

2.5 微生物多糖

自上世纪80年代起就有多种微生物多糖以剂、稳定剂、成膜剂、增稳剂、乳化剂、悬浮剂、胶凝剂、增稠剂等形式应用在各类食品工业生产中，并且品种在不断的增加。我国工业生产中目前常见的微生物多糖有短梗霉多糖、食用菌多糖、右旋糖酐、热凝多糖、黄原胶、小核菌葡聚糖等，经过微生物发酵技术深层发酵可生产出猴头菇多糖、香菇多糖、银耳多糖、金针菇多糖、银耳多糖等多种品种，能够增强人体体液免疫及细胞免疫功能，提升抗病菌感染、抗肿瘤、抗病毒等能力，在保健食品研发与生产中得到了广泛的应用。

2.6 发酵茶

发酵茶是在制作茶叶的过程中添加微生物发酵工序制成的，分为轻发酵（未经历发酵过程）、半发酵（发酵程度在21.00～70.00%之间）、全发酵（发酵程度100.00%）以及后发酵（在制茶工序末端添加发酵工序）四种类型。利用微生物发酵技术制茶能够分解、减少茶内的茶多酚物质，增加茶多酚氧化物，因此不仅可以减小胃部受茶多酚的刺激影响还可以养胃，比如乌茶、红茶等。此外，茶叶含有的维生素、咖啡碱等物质能够促进脂肪的氧化，起到减肥的功效。

2.7 酒饮料

我国的酿酒工艺流传已久，现代酿酒业已发展为我国经济重要支柱产业，利用微生物发酵技术能够丰富酿酒品种，提升口感。比如药酒、奶酒、黄酒、白酒、露酒、果酒、啤酒等，不仅香味十足，口感佳，而且还具有杀菌开胃、镇静安神、消炎散瘀、活血、延年益寿等多种独特的功效。

2.8 发酵肉制品

在制作肉类食品时采用微生物发酵技术可改变食物口感，提升营养价值，比如腊肉、生火腿、发酵香肠等均为肉制品经过发酵制成，不会破坏食物的营养成分，而且风味独特，更易携带和保存。微生物发酵技术可分解肉类食品中的蛋白质，将其转化为氨基酸，增加氨基酸，从而更利于人体对蛋白质的吸收和消化，还可以增加人体必要的双歧杆菌素、维生素，极大地增强了肉制品的保健功能与营养，此外还可以减少食物中亚硝酸盐残余，起到防癌的功效。

3 结束语

随着时代的发展，健康成为人们越来越关注的问题，人们的饮食观念也由过去的吃饱变为吃得健康，健康饮食成为社会重要话题之一。微生物发酵工程技术的应用不仅可以最大限度地保留食物原有的营养成分，改变口感，而且还增加了食物的保健功效，不仅使现代饮食更加丰富，而且对人们的身体健康起到积极的作用。

参考文献

[1]藤晖，曾新安，蔡锦林.现酵工程技术在食品开发中的应用[J].2016（3）：7-10.

篇4

血管新生是指在原有血管结构的基础上通过芽生或套叠增生的方式形成新血管的生物学过程。肝脏在生理和某些病理情况下均可见到血管新生，生理性见于肝脏再生，病理性可见于肝纤维化、肝硬化。研究表明血管新生与慢性肝炎、肝纤维化进程有关，甚至是其促进因素。血管新生是肝纤维化的关键病理变化，能促进细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）生成、门脉高压的产生，现已证实抗血管新生治疗可有效阻止肝纤维化进展。肝窦内皮细胞（liver sinusoid endothelial cell，LSEC）是肝纤维化血管新生的细胞学基础。五味子味酸，甘，性温，具有收敛固涩、补肾宁心、益气生津等功效，含木脂素类、三萜类、倍半萜类、生物碱类、有机酸、挥发油等多种化学成分，五味子酯甲是木脂素类成分之一，能直接吸收入血，发挥抗肝纤维化作用。本研究采用血管内皮生长因子（vascular en-dothelial growth factor，VEGF）诱导SK-HEP-1细胞增殖、细胞迁移与管腔形成、大鼠主动脉环实验与斑马鱼模型，进一步评价五味子酯甲抑制肝窦内皮细胞功能及血管新生的活性。

1 材料

五味子酯甲购自上海融禾医药科技发展有限公司；索拉非尼（sorafenib），VEGF/PDGF受体酪氨酸激酶及丝/苏氨酸激酶抑制剂购自Bayer公司。

SK-HEP-1细胞株（ATCC Number：HTB-52TM）购自中国科学院上海细胞库，为内皮来源人肝癌细胞株。

SD大鼠，6～7周龄，SPF级，购于中国科学院上海实验动物中心，许可证号SYXK（沪）2007-0005。

Minimum Essential Medium（MEM），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自GIBCOTM公司；二甲基亚砜（DMSO），Fibronectin噻唑蓝（MTT）购自Sigma公司；Recombinant Rat Vascular Endothelial GrowthFactor（VEGF Rat）购自Prospe公司；EdU细胞增殖试剂盒（Cell-LightTM EdU DNA Cell Proliferation Kit）购自广州锐博生物科技有限公司；NO荧光探针，NOS试剂盒，结晶紫染液购自碧云天生物技术研究所。Matrigel购自BD Biosciences公司。Transwell24孔板购自美国Coming公司。

2 方法

2.1 细胞培养 SK-HEP-1细胞以10%FBS/MEM培养液培养，每3～4d传代1次。

2.2 药物配制 ①每1L MEM培养基含MEM干粉1袋，NaHCO，2.2g，4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）2.38g，青霉素0.0625g，链霉素0.1g。②胰酶1L含Trysin 2.5g，乙二胺四乙酸（EDTA）0.2g，NaCl8g，KCl 0.4g，Na2HPO4・12H2O 0.134g，KH2PO4 0.06g，NaHCO30.35g。③L-谷氨酰胺100mL：L-谷氨酰胺2920mg加ddH2O至100mL。④PBS缓冲液1L含NaCl8g，KCl 0.2g，Na2HPO4・12H2O 3.58g，KH2PO4 0.26g。

2.3 细胞模型 SK-HEP-1细胞以每孔8000个接种于96孔板，待细胞长至亚单层，弃培养液，VEGF以0.4%胎牛血清稀释，20μg・L-1VEGF与SK-HEP-1细胞共孵育24h，同时设0.4%胎牛血清培养液作为对照。

2.4 MTF法 药物孵育24h后，弃药液，加入0.5g・L-1MTY工作液，孵育4h。小心吸弃工作液，加入DMSO100μL/孔，至充分溶解，在微孔板扫描分光光度计上测定吸光度A490。

2.5 Edu法 药物孵育24h后，弃培养液，每孔加入50μmol・L-1EdU溶液100μL孵育2h后，弃上清，每孔加入4%多聚甲醛100μL室温固定15min，0.2%甘氨酸孵育10min，PBS洗涤5min，2次，0.5%Triton X-100透膜10min，PBS洗涤5min，Appllo染色反应液避光孵育30min，PBS洗涤5min，DAPI（1：1000）避光孵育5min，PBS洗涤5min，2次，Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader采集图像，Cellomics Cell Health Profiling BioApplicationSoftware对图像进行分析。

2.6 荧光探针法 胞内NO水平的检测：药物孵育24h后，弃培养液，每孔加入原位装载5μmol・L-1DAF-FMDA（NO探针）100μL孵育20min后，PBS洗涤3次。Thermo scientific varioskan flash光谱扫描多功能读数仪上检测，激发波长495nm，发射波长515nm。NOS活性检测：药物孵育24h后，弃培养液，每孔加入NOS检测缓冲液、检测反应液各100μL，孵育2h后PBS洗涤3次。Thermo scientificvarioskan flash光谱扫描多功能读数仪上检测，激发波长495nm，发射波长515nm。

2.7 细胞迁移试验 Transwell小室的下室以1mg・L-1纤维粘连蛋白37℃细胞培养箱内包被过夜。细胞同步化后，胰酶消化，离心，用0.4%胎牛血清调整细胞密度至2×105个/mL，上室加入细胞和药物培养液各150μL，药物组各设3个复孔，下室加5%胎牛血清细胞培养液600μL孵育8h后弃上下两室培养液，4%多聚甲醛固定细胞，PBS洗涤，结晶紫染色10min，PBS洗涤。Olympus倒置显微镜下观察细胞迁移情况，拍摄。

2.8 细胞管腔形成试验 每孔加100μL Matri-ge1聚合1h，细胞胰酶消化后调整细胞浓度至5×104个/mL与药物培养液按1：1混合，每孔200μL铺在matrigel上，孵育8h。Olympus倒置显微镜下观察，拍摄。

2.9 大鼠主动脉环试验 将主动脉分切成1mm血管环备用。每孔60μL matrigel聚合20min后，加入一主动脉环，放置10min。另加60μLma-trigel于主动脉环上，聚合30min。加100μL含青链霉素的2%FBS，孵育6d后弃培养液，0.4%FBS饥饿6h。Olympus倒置显微镜下观察，拍摄，计作0h；加药物培养液，孵育24h，Olympus倒置显微镜下观察，拍摄，计作24h。

2.10 斑马鱼试验 转基因斑马鱼（VEGFR：GFP）受精卵发育24h，移至96孔板中，每孔预加入受试样品溶液，每5个孔为同一浓度，对照为胚胎培养用水加相应量的助溶剂，加盖封闭，置于光照培养箱（28℃）内继续发育24h，于倒置显微镜下观察，记录节间血管的血流数。麻醉，荧光显微镜下对节间血管进行计数并拍照。观察结束后，4%多聚甲醛中固定，甲醇脱水，丙酮透化，碱性磷酸酶染色，显微镜下拍照。

2.11 统计学处理 计量资料用x±s表示。所有数据均使用SPSS12.0软件包进行统计学分析，组间比较使用单因素方差分析，P

3 结果

3.1 五味子酯甲对SK-HEP-1细胞活力的影响分别以含2.5～40μmol・L-1五味子酯甲培养液孵育SK-HEP-1细胞24h，MIT法检测细胞活力，2.5～20μmol・L-1五味子酯甲对SK-HEP-1细胞活力明显抑制，40μmol・L-1对SK-HEP-1细胞活力抑制率达到70%，后续药效试验选择2，20μmol・L-1五味子酯甲（图1）。

3.2 五味子酯甲对VEGF诱导的SK-HEP-1细胞增殖的影响 与空白对照组相比，VEGF刺激明显诱导SK-HEP-1细胞增殖；与索拉非尼作用相似，2，20μmol・L-1五味子酯甲显著抑制VEGF刺激的SK-HEP-1细胞增殖，具有一定剂量依赖性（图1）。

3.3 五味子酯甲对SK-HEP-1 细胞内一氧化氮（NO）含量与NOS活性的影响与空白对照组相比，VEGF刺激的SK-HEP-1细胞内NO含量与NOS活性明显升高；索拉非尼、五味子酯甲降低VEGF诱导的SK-HEP-1细胞内NO含量与NOS活性，其中2，20μmol・L-1五味子酯甲呈现一定剂量依赖性（图2）。

3.4 五味子酯甲对VEGF诱导的SK-HEP-1细胞迁移的影响 与空白对照组相比，VEGF组促进SK-HEP-1细胞迁移；与VEGF组相比，2.5μmol・L-1索拉非尼组、20μmol・L-1五味子酯甲组明显抑制SK-HEP-1细胞迁移（图3）。

3.5 五味子酯甲对VEGF诱导的SK-HEP-1细胞管腔形成的影响 与空白对照组相比，VEGF促进SK-HEP-1细胞管腔形成；与VEGF组相比，2.5μmol・L-1索拉非尼组、20μmol・L-1五味子酯甲组均明显抑制SK-HEP-1细胞管腔形成（图3）。

3.6 五味子酯甲对VEGF诱导的大鼠主动脉环血管生长的影响 与空白对照组相比，VEGF组促进大鼠主动脉环血管生长；与VEGF组相比，2.5μmol・L-1索拉非尼组、20μmol・L-1五味子酯甲组均显著抑制大鼠主动脉环血管生长（图3）。

3.7 五味子酯甲对斑马鱼血管的影响 与空白对照组相比，100μmol・L-1索拉非尼组绿色荧光标记的斑马鱼血管数明显减少，五味子酯甲组无明显变化；与空白对照组相比，100μmol・L-1索拉非尼、100μmol・L-1五味子酯甲斑马鱼节间血管数显著减少；与空白对照组相比，100μmol・L-1索拉非尼、100μmol・L-1五味子酯甲可显著减少斑马鱼功能血管数量（图4）。

4 讨论

肝硬化患者和实验性肝纤维化动物肝脏中均能见到血管新生现象，血管新生既可以是慢性肝损伤后组织修复中微血管重塑的表现，也与肝纤维化的发展有密切的关系，采用索拉非尼干预血管新生可减轻肝纤维化。促进血管新生的细胞因子有VEGF，转化生长因子-β（transforming growth fac-tor-β，TGF-β），成纤维细胞生长因子（fibroblastgrowth factor，FGF），血小板源生长因子（platelet de-rived growth factor，PDGF）等。纤维化时，肝脏中VEGF表达上调，主要表达在内皮细胞（endothelialcell，EC）和活化肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）中，可促进EC分裂、增殖，迁移，诱导纤维蛋白原激活物和胶原酶的表达，增加血管的通透性，使用特异性中和抗体阻断VEGF信号可减轻肝纤维化。

SK-HEP-1细胞株是无限增殖的人肝窦内皮细胞株，具备肝窦内皮细胞的两大关键特点：一是窗孔结构，二是细胞内吞作用（肝窦内皮细胞关键功能特点），因此，SK-HEP-1细胞是进行体外物质筛选理想的细胞载体。索拉非尼是一种多激酶抑制剂，不仅可以抑制多种受体酪氨酸激酶活性，还可以抑制丝氨酸―苏氨酸激酶活性。作为多靶点受体酪氨酸激酶抑制剂，该药物不仅具有抑制血管新生作用，最近一些研究表明，该药具有良好的抗肝纤维化作用。