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1.1 BM-MSCs的来源及形态
BM-MSCs从骨髓、脂肪组织、骨骼肌、成人外周血、血管周皮细胞、妊娠4-6个月羊水、胎儿的血和真皮组织、脐血中都可以分离得到间充质干细胞[4]，其中对BM-MSCs研究最充分最彻底。BM-MSCs表现出早期细胞的特点，呈均一的成纤维细胞形态，染色质疏松，核仁明显，核浆比例大，辐射状或漩涡状排列，可聚集成均匀的集落。
1.2 BM-MSCs的鉴定
鉴定BM-MSCs目前没有特异性的表型标志，研究从形态、表型及多分化功能来鉴定体外分离培养的BM-MSCs [5-6]，纯化的BM-MSCs表现为成纤维细胞梭形贴壁细胞，呈漩涡状、平行状或鱼群状生长； BM-MSCs的抗原表型，流式细胞仪检测不表达造血细胞CD14、CD34、CD45的标志，表达CD29、CD44、CD73、CD90、CDl06、CDl24、SH-2、SH-3、SH-3等；BM-MSCs具有跨胚层的多向分化，如成骨、成软骨、成脂肪，是BM-MSCs作为干细胞最基本特征[7]。故BM-MSCs常通过负性筛选和细胞多向分化，鉴定BM-MSCs。
1.3 BM-MSCs的分离培养
BM-MSCs在骨髓中含量很少，生理状态下20％为静止期细胞，所以BM-MSCs要应用于临床，其分离培养显得尤其重要。目前分离获取BM-MSCs的方法主要有4种[8-9]：全骨髓差异贴壁法、免疫磁珠法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法。全骨髓差异贴壁法获取BM-MSCs，操作简单，保存了骨髓环境中丰富的粘附分子和各种生长因子的营养作用及其他细胞成分的支持作用，通过换液去除非贴壁的血细胞和造血细胞，提高了原代培养的成功率。免疫磁珠法和流式细胞仪分离法分选程度高，但需联合多个表面标志，且分选过程中对细胞的生物活性影响较大。密度梯度离心法根据骨髓细胞成分的密度不同，应用Ficoll或淋巴细胞分离液Percoll进行分离BM-MSCs，但分离液对细胞都有一定的毒性作用，造成细胞损伤，影响细胞的活性，使BM-MSCs培养困难。采用全骨髓差异贴壁法分离培养BM-MSCs，第一代纯化可以达到92％，第二代纯化超过96％[10]。
2 BM-MSCs诱导分化为肝样细胞的实验研究
骨髓干细胞研究的升温，其替代或作为过渡肝移植、肝细胞移植、肝干细胞移植治疗终末期肝脏疾病越来越成为可能。目前，国内外众多机构对体内、外骨髓干细胞向肝细胞的横向分化做了大量的工作，使干细胞移植成为基础和临床研究的热点。
2.1 BM-MSCs体内诱导分化为肝样细胞的研究
自从Petersen等[11]报道大鼠骨髓中的某个细胞群体具有分化为肝样细胞和胆管上皮细胞的潜能。这一结果提示，根据干细胞所处微环境的不同，其分化方向亦有较大的可塑性。有研究报道BM-MSCs是应激状态下肝再生细胞的主要肝外来源[12]。Theise等[13]将雌性小鼠给予致死量放射线照射，并将雄性小鼠的骨髓移植到该雌性小鼠体内，实验结果发现在雌性小鼠肝脏有部分细胞表达Y染色体同时表达肝细胞标志ALBmRNA，认为移植的骨髓干细胞在小鼠中能分化为肝样细胞。动物肝损伤后其体内产生大量对肝细胞生长有利的因子，利用这一特殊内环境对BM-MSCs进行诱导分化。Terai等[14]首先建立CCL4诱导的小鼠肝硬化模型，然后从尾静脉注入lxl05个经绿色荧光蛋白(GFP)标记的BM-MSCs，4周后肝脏中有25％的细胞是BM-MSCs，并横向分化为能分泌ALB的肝样细胞。AvitaI等[15]采用免疫磁珠分离法从大鼠和人骨髓中分离出β2-m-/Thy-1+细胞，这些细胞同时表达其他肝细胞特异性标志物ALB、AFP、CK-18。Yukiko Saji[16]等鉴定了在肝损伤小鼠模型体内碱性成纤维生长因子能促进BM-MSCs分化为肝样细胞，并且提高了ALB的表达，且能在增殖过程中保留BM-MSCs的多向分化潜能。
2.2 BM-MSCs体外诱导分化为肝样细胞的研究
研究表明骨髓干细胞在体外能诱导分化为肝系细胞，调控肝再生的细胞因子包括：肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子a(TGF-a)、肝细胞再生刺激因子(HSS)、抑瘤素M(0SM)等[17]。Oh等[18]在体外培养的大鼠骨髓细胞中加人HGF诱导BM-MSCs向肝样细胞诱导分化实验，经诱导后显微镜下可观察到肝细胞样形态，用免疫细胞化学法检测到ALB和CKl8。HGF它是一种普遍存在并具有多能性的细胞因子，对表达C-met的多种细胞的有丝分裂及塑形都具有刺激作用并通过与受体C-met相互作用而对多种细胞产生促有丝分裂作用，促进细胞增生，影响细胞迁移[19]。Oklumoto等[20]采用阴性选择磁场细胞分离系统得到丰富的BM-MSCs，将其与肝细胞共同培养7d后经RT-PCR检测出BM-MSCs分化为具有表达AFP和ALBmRNA的肝特异性标志的细胞。Lee KD[21]等采用两步法诱导方案，将骨髓来源的间充质干细胞分离后，首先接种于含20 ng/ml表皮生长因子(EGF)和10 ng/ml成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)培养液中培养7d后改为肝细胞生长因子（HGF）和抑瘤素M（OSM），诱导培养2周后，表达ALB、CKl8，4周后开始分泌尿素，实验结果提示BM-MSCs诱导分化为有肝细胞功能的细胞。FGF被认为是肝细胞发生的初始生长因子。Schwartz RE等[22]从骨髓中分离出BM-MSCs，在培养体系中加入HGF、FGF-4等生长因子诱导后间充质干细胞向肝细胞分化。bFGF是一个肝素结合的多肤类丝裂源，广布于各种组织中，可促进胚胎肝脏的形成和发育，并具有广泛的生物活性，可影响细胞的粘附、增殖和分化，不仅能提高BM-MSCs的增殖速度及其寿命，且能在增殖过程中保留BM-MSCs的多向分化潜能。可见，提供适宜的诱导和微环境，BM-MSCs在体外能得到很好的扩增和定向分化为肝样细胞。
3 展望
目前对骨髓间充质细胞的研究还处于理论阶段，研究仍然以动物实验为主，要达到治疗水平的肝脏重建尚存在大量的问题需要解决，如何使BM-MSCs稳定地传代时又保持良好的分化潜能；如何寻找和鉴定MSCs所特有的细胞表面标志分子；诱导BM-MSCs的分子机制。开关基因是什么?分化中各种组织特异性生长因子。营养因子等各自起到何种作用。上述干细胞体外培养的安全性还值得进一步研究。随着对BM-MSCs研究的不断进展，有理由相信，BM-MSCs将替代成熟肝细胞而成为肝细胞移植或生物人工肝的一种新来源。
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【关键词】 血管紧张素Ⅱ; 5-氮杂胞苷; 骨髓间充质干细胞;心肌样细胞
[Abstract] Objective To observe the effect of the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells(BMMSCs) into cardiomyocyte-like cells with 5-azacytidine and angiotensinⅡ.Methods BMMSCs were isolated from bone marrow of SD mouse by density gradient centrifugation. The third passage cells were pided into four groups:AngⅡgroup (0.1μmol/ L)，5-aza group(10μmol/L)，AngⅡ combined with 5-aza group (0.1μmol/L and 10μmol/L)，untreated group as control. After 24h induction， the medium was changed to complete culture medium without any inductor and the cells were culture for 4 weeks. The morphological changes were observed under phase contrast microscope. The effect of AngⅡ and 5-aza on the BMMSCs proliferation was observed with methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay. The cardiomyogenic cells were identified by immunofluorescence staining. The differentiation ratio was examined by flow cytometer. The ultrastructures of the induced cells were viewed with a transmission electron microscope.Results BMMSCs of primary culture formed cell colonies at 14 days. The passaged cells were larger than those of primary culture. After induction， the cells presented long spindle， aligned in parallel and formed “muscle island”- like structure. MTT assay showed that the cell proliferation in AngⅡ and 5-aza group outweighed that of in AngⅡgroup or 5-aza group. The expression of specific protein of cardiac troponin I (cTnI) in induced BMMSCs was positive. Flow cytometer showed that the differentiation ratio in AngⅡgroup，5-aza group and AngⅡ combined with 5-aza group were respectively(25.3±2.2)%，(24.6±1.9)%，(30.0 ±1.7)%， demonstrating that the differentiation ratio in AngⅡ combined with 5-aza group was higher than that of in AngⅡ group or 5-aza group(P>0.05). Transmission electron microscopy showed that the induced cells had myofilaments， Z line-like substances.Conclusion AngiotensinⅡ combined with 5-Azacytidine can induce the differentiation of BMMSCs into cardiomyocyte-like cells， and the differentiation ratio was higher than that of in 5-aza only.
[Key words] angiotensin Ⅱ;5-azacytidine;bone marrow mesenchymal stem cells;cardiomyocyte-like cells
缺血性心脏病在我国的发病率逐年升高，严重威胁着人类的生存及生活质量。近几年来，细胞移植技术发展迅速，借助此技术可以在坏死部位移植具有收缩功能的细胞，为治疗缺血性心脏病提供了新的方法，也成为治疗缺血性心脏病的研究热点课题。随着研究的深入，选用的靶细胞目前多集中于有多向分化能力的各种干细胞，其中研究的较多的是骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs)[1]，有研究显示BMMSCs可以被化学物质 5-氮杂胞苷 (5-azacytidine， 5-aza)诱导为心肌样细胞[2，3]。也有研究显示，血管紧张素Ⅱ在体外可能经细胞外信号调节激酶通路诱导人BMMSCs向心肌样细胞分化[4]，提示血管紧张素Ⅱ对BMMSCs的分化发挥重要作用。于是我们设想：血管紧张素Ⅱ联合5-氮杂胞苷共同诱导能否提高BMMSCs向心肌细胞的分化率 ?与单纯血管紧张素Ⅱ及单纯 5-aza的诱导作用相比又有何差别?本实验即通过联合诱导培养，观察血管紧张素Ⅱ联合5-氮杂胞苷对 BMMSCs向心肌细胞分化所起的作用，并与传统诱导分化剂 5-aza比较。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与实验动物 AngⅡ ( Sigma， USA)， 5-azacytidine ( Sigma， USA)，L-DMEM 培养基(Hyclone， USA)，胎牛血清(杭州四季青)， 胰蛋白酶(Sigma， USA)， Ficoll 淋巴细胞分离液(1.077g/ml，TBD公司)， MTT (Sigma，USA)，DMSO (Sigma，USA)，羊抗鼠cTnI抗体(Santa cruz)，FITC标记的抗羊IgG (Boster)，Hoechst33258 (Sigma， USA)。健康SD 大鼠，4周龄，质量80～100g，雄性，由第四军医大学动物实验中心提供。
1.2 方法
1.2.1 BMMSCs的体外分离和培养 颈椎脱臼法处死大鼠，取其四肢长骨，75%酒精浸泡5min。无菌条件下分离出胫骨和股骨，剪除两端骨骺，用不含血清的DMEM培养液冲洗骨髓腔，充分混匀。将细胞悬液缓慢加入含淋巴细胞分离液的离心管中，2000r/min， 离心20min。取中间云雾状有核细胞层， 加入L-DMEM不完全培养液，充分混匀后，1500r/min， 离心10min，弃上清，加入完全培养液，充分混匀后，调整细胞密度为1×106/ml，接种于T-25塑料培养瓶， 37℃含体积分数为0.05的CO2孵箱中饱和湿度培养。3天后首次换液， 除去不贴壁的悬浮细胞，以后每3天换液1次。待细胞长到80%融合时， 用2.5g/L胰蛋白酶进行消化，按1：2的比例进行传代。体外培养至第3代备用。
1.2.2 BMMSCs的诱导分化 将传至第3代的BMMSCs进行分组诱导，共分为4组：(1)AngⅡ组(终浓度为0.1μmol/L);(2)5-aza组(终浓度为10μmol/L);(3)AngⅡ加5-aza组(终浓度分别为0.1μmol/L、10μmol/L);(4)空白对照组， 仅用基本培养基诱导。各组诱导24h后更换完全培养基继续培养，每3天换液1次， 并观察细胞形态变化， 连续培养4周。
1.2.3 形态学鉴定 每日在倒置显微镜下观察诱导前、后细胞生长和形态变化。
1.2.4 MTT法检测细胞活性并描绘细胞增殖曲线 将第3代BMMSC以1×105/ml接种于4个96孔板中， 每块板选取24孔，分为4组，每组6孔，每孔加200μl细胞悬液。培养24h后吸弃孔内培养液，PBS洗涤2次，前3组分别加入含AngⅡ、5-aza、AngⅡ和5-aza的诱导培养液，第4组加入基本培养基作为对照组。诱导24h后各组更换完全培养基继续培养。于培养 1、3、5、7天后进行MTT 检测，每孔加入20μl MTT(5mg/ml)，孵育4h后终止培养。弃孔内上清液，每孔再加入150μlDMSO， 打匀振荡10min，使结晶物充分溶解。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(A)，并描绘细胞增殖曲线。
1.2.5 免疫荧光细胞化学检测 将诱导培养1、2、3、4 周的细胞进行爬片，4%的多聚甲醛固定，3%过氧化氢-甲醇室温孵育10min ，正常山羊血清封闭，加cTnI抗体，4℃过夜，PBS冲洗，加FITC标记的二抗，37℃孵育40min，PBS 冲洗，Hoechst33258室温孵育10min，PBS 冲洗，甘油封片，荧光显微镜观察并拍照。
中国已经步入老龄社会，进一步倡导尊老敬老的传统文化尤其显得必要。有数据表明：中国60岁以上老年人人口已经超过了1.3亿，占全国人口的10%以上。到本世纪中叶，中国老年人口将达4亿，占全国人口的1/4。
“花无重开日，人无再少年。”总有一天我们也会成为老人。作为**三小的学生，我们应该发扬尊老、爱老的优良传统。在重阳节这天，向爷爷、奶奶、外公、外婆致以节日的问候，感谢他们为自己所做的一切;在平时，帮助他们做些力所能及的家务活，关心照顾他们，多陪他们聊聊天，从每一件小事做起，做他们的乖孙子。同时向社会的爷爷、奶奶伸出关爱、帮扶之手。