白猫计划范文
时间：2022-08-31 05:30:00
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篇1
我在近20年前写作《全球化是否过犹不及》（Has Globalization Gone Too Far？）一书时，曾经请一位著名经济学家撰写推荐跋。我在书中说，如果没有更加协调的政府应对机制，过度全球化将深化社会分裂，加剧分配问题，破坏国内社会契约―该书出版后，这些观点都成为常规智慧。
这位经济学家对此持有异议。他说，他并不真的反对其中的分析，但是担心我的书会“为野蛮人提供火力”。保护主义者会抓住书中关于全球化弊端的论点，为他们的狭隘自私的日程提供支持。
我们的观点被我们所反对的人在公共辩论中劫持，这样的风险永远存在。但我始终不明白，为何许多经济学家认为这意味着我们应该让我们的贸易观点呈现出一边倒的状况。潜在的假设似乎是，野蛮人只存在于贸易争论的一边。显然，他们认为抱怨世界贸易组织或贸易协定的人是可怕的保护主义者，而那些支持世贸组织和贸易协定的人永远是天使。
事实上，许多贸易支持者也完全是出于自身狭隘自私的日程。制药企业追求更严格的专利规则，银行推动外国市场的完全开放，寻求特别仲裁法庭的跨国公司对公共利益的关心绝不会比保护主义者多。因此，当经济学家遮掩观点时，他们实际上是为了躲避一群野蛮人而便利了另一群野蛮人。
对经济学家来说，有一个存在已久的不成文的公共参与规则，即他们应该站出来支持贸易，不要扭扭捏捏。这造成了一个有趣的局面。经济学家日常使用的标准贸易模型，常常会产生剧烈的分配效应：某个生产者或工人群体收入损失，另一些人“从贸易中获益”，此乃同一枚硬币的两面。经济学家早就知道市场失灵―包括劳动力市场功能失调、信用市场不完美、知识和环境外部性、垄断等―可能起到干扰作用，让这些好处无法获得。
他们还知道，影响国内监管的跨境贸易协定的经济收益，比如收紧专利规则或调和健康与安全要求，从根本上是模棱两可的。
尽管如此，凡是有贸易协定出台，人们永远希望经济学家高举比较优势和自由贸易的大旗。他们一直在尽量减小分配顾虑，即使如今已经十分清楚，（比如）北美自由贸易协定或中国加入世贸组织的收益效应，对于美国最直接的受影响群体而言是非常大的。他们过分强调来自贸易协议的总收益，尽管这些收益至少从20世纪90年代以来已经相对较小。他们大力渲染今天的贸易协议是“自由贸易协定”，哪怕亚当・斯密和大卫・李嘉图看到跨太平洋合作伙伴协定的话肯定会气得从坟墓里站起来。
经济学家不愿意在贸易问题上说实话，这导致他们在公众面前失去信誉。更糟糕的是，这有利于他们的反对者的话语权。经济学家没有提供完整的贸易图景，没有说明白必不可少的区分和警告，这让贸易的各种副作用更加容易被错误地渲染。
比如，贸易固然可能导致不平等性加剧，但它只是推动这一广泛趋势的因素之一―并且其作用远远不如科技。如果经济学家能够预先普及贸易的弊端，他们本应在这场争论中拥有更高的信誉，被视为诚实的真理代言人。
篇2
1引言
转铁蛋白（Trf）是脊椎动物体中一种非血红素结合铁的馇虻鞍祝捎胂赴ど系rf受体结合，内吞化形成内吞小体。在特定信号介导下，Trf可以通过释放铁离子，转移出细胞膜外。由于恶性肿瘤细胞过度表达Trf受体，因此，通过标记Trf可进行肿瘤细胞的识别、诊断和治疗研究[1，2]。量子点作为一种新型荧光材料，近年来在生物成像研究中快速发展，特别是在细胞可视化研究方面[3～11]。量子点用于细胞标记一般需将量子点与靶蛋白偶联，再通过靶蛋白结合在细胞膜或进入胞内显示量子点的荧光，由此进行靶蛋白在细胞膜及胞内的定位及成像分析。因此靶蛋白与量子点的偶联体系的构建是量子点生物成像应用的基础。
本研究选取Trf为靶蛋白，通过其与细胞膜上的Trf受体结合，进而转运靶蛋白量子点的偶联物。目前，量子点与蛋白质的偶联多采用生物素亲和素法、共价法及静电吸附法等。蛋白质与量子点偶联时，二者的混合比例决定偶联产物的质量以及生物功能化的效果。在量子点与蛋白质的偶联反应中建立高效、快速、低成本方法进行表征，对于偶联体系的优化，提高偶联效率非常必要。本研究利用毛细管电泳激光诱导荧光法（CELIF）的高效、快速、高灵敏和样品用量少等优势，对Trf与量子点CdTe偶联的方法和条件进行快速优化，并将得到的CdTeTrf偶联物不经分离而直接用于Hela细胞标记。通过激光共聚焦显微镜进行标记效果的成像观察。实验结果表明， CdTeTrf偶联物具有Trf的生物功能，并能特异性识别细胞膜表面的Trf受体，在其介导下可转运到Hela细胞内，分布在胞质中。CELIF法也适用于其它荧光纳米材料的表面功能化效率表征，包括偶联剂种类的选择和反应比例的优化、偶联产物的性质表征等，具有一定的通用性。
3结果与讨论
采用CELIF进行偶联条件优化可得到偶联产物的定性与定量信息，如荷电性质、荷质比、荧光强度、稳定性等，有助于最佳条件的判断和选择。
3.1偶联剂活化后量子点的表征
因所用量子点是以巯基乙酸为稳定剂在水相中合成而得，故量子点表面包覆着一层羧基，而量子点与Trf的偶联则通过量子点表面的羧基与蛋白质表面的氨基间的酰胺反应完成。NHS和EDC为常用的亚胺偶联剂，实验中对比了以NHS及NHS和EDC混合偶联剂（EDCNHS）活化的量子点性能（图1）。
由图1a可见，以单一偶联剂NHS活化的量子点其荧光强度高且峰形尖锐，说明单一偶联剂NHS活化的量子点粒径均一，有利于减少量子点表面缺陷，增强量子点荧光效率。当使用混合偶联剂活化时，量子点的峰形较宽，峰强度较低（图1b），说明混合偶联剂可能导致量子点的稳定性降低，量子点间产生一定程度的团聚。导致其峰高降低，峰展宽。对比图1a和图1b可见，单一偶联剂NHS活化后量子点性能好于混合偶联剂EDCNHS活化的量子点。因此后续实验均采用NHS偶联剂对量子点进行活化[12，14]。
3.2量子点偶联Trf的条件优化
NHS的存在使Trf可有效的偶联于CdTe表面，形成类似核壳结构的CdTeTrf偶联产物。由图2A第一个电泳图可见，产物峰（3.3 min）相对于活化后的CdTe（图1a， 6.3 min）迁移时间缩短，即量子点偶联蛋白后迁移加快，说明Trf确实已偶联于CdTe表面，且偶联产物表面电荷性质以及整体的荷质比更接近于蛋白质的迁移时间（约3.0 min）。因此说明不同Trf浓度下形成的偶联产物均以CdTe为核，以Trf为壳，呈现为核壳复合物。
随偶联蛋白Trf浓度的增加，偶联产物的荧光强度变化如图2B。当Trf的浓度低于31.2 olL时，随Trf的浓度增加，偶联产物荧光强度明显增强。说明包覆于表面的Trf对CdTe表面的晶格缺陷有所改善。Trf的包覆量越多，CdTe表面越完善，荧光强度越高。但当Trf浓度高于31.2 olL，荧光强度转而开始下降。说明偶联反应在31.2 olL时已达饱和，CdTe表面完全被Trf包覆，而溶液中过量的游离Trf不仅对功能化的量子点有一定的荧光猝灭作用，而且在后续偶联体系标记细胞时，游离的Trf将与偶联产物CdTeTrf一起竞争细胞上的Trf受体靶标，严重干扰CdTeTrf对细胞表面Trf受体的标记。因此，采用CELIF法对量子点偶联条件进行优化，简单快速，可明确判断蛋白质是否偶联于量子点表面，更有利于严格控制Trf与CdTe的反应比例，提高偶联效率和细胞标记效果，后续标记时不需要对偶联体系的产物进行分离纯化。由于Trf浓度增高，会使溶液粘度增加，导致电泳峰展宽，因此采用峰面积考察荧光强度变化。
篇3
本实验用本课题组前期构建的fimA基因的原核表达质粒pET-15b-fimA，在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达后，fimA基因得到正确表达。
4 实验二 FimA蛋白的纯化与鉴定
4.1 实验材料与仪器
4.1.1 菌珠
携带有pET-15b Vector和pET-15b-fimA的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS：实验一获得。
4.1.2 主要试剂
1）BCA法蛋白定量试剂盒：碧云天公司
2）TALON纯化试剂盒：Clontech Laboratories，Inc，USA
3）其他：同实验一
4.1.3 实验仪器
1）宝特ELX-800酶标仪：宝特仪器有限公司
2）其他：同实验一
4.2 实验方法 4.2.1 样品制备
按照TALON纯化试剂盒操作说明书制备样品，步骤如下：
1）在转化了质粒pET-15b-fimA的LB固体培养基上，用接种环挑取阳性克隆菌落，接种于5 ml Amp+(100 μg/ml)的LB培养液中，37℃振摇过夜。
2）将5 ml过夜菌转接于500 ml LB(Amp+)培养液中，37℃振摇4 h；加入IPTG致终浓度为2 mmol/L ，37℃振摇3 h。
3）4℃，5500 r/min离心20 min收集细菌沉淀，弃上清，沉淀置于冰上或－20℃保存。
4）用Buffer A（pH 7.0）重悬细胞沉淀物，每25 ml细胞培养物使用2 ml缓冲液。
5）轻轻振荡样品直到它变得半透明为止。
6）4℃，10000～12000 r/min离心20 min以去除不溶性杂质。
7）小心的转移上清液到一个干净的离心管，不要触动沉淀物。离心管中的澄清的上清液就是样品了。
4.2.2 分批/重力流柱子纯化FimA蛋白
按照TALON纯化试剂盒操作说明书进行，步骤如下：
1）彻底重悬TALON树脂。
2）快速转移3 ml树脂悬液入一个无菌的离心管，700 g离心2 min，弃上清。
3） 加入10倍柱床体积的Buffer A（pH 7.0），小心混匀以平衡树脂，700 g离心2 min，弃上清。
4）重复步骤3。
5）加入4.2.1所制备的样品。
6）室温下，小心搅拌上一步所得混合液20 min，700 g离心5 min。
7）小心移除尽可能多的上清液，注意不要触碰到沉淀在离心管底的树脂。
8）用10～20柱床体积的Buffer A（pH 7.0）冲洗树脂。室温下，小心搅拌悬液10 min，以达到更彻底的冲洗效果，700 g离心5 min，弃上清。
9）重复步骤8。
10）加入1倍柱床体积的Buffer A（pH 7.0），重悬混合。
11）转移树脂到一个2 ml的重力流层析柱中，缓冲液从层析柱底部引流出来直至到达柱床顶部，该过程中要确保树脂柱床中不能有气泡进入。
12）用五倍柱床体积的加入了8 mM的咪唑的Buffer A（pH 7.0）冲洗柱子。
13）加入5倍柱床体积的Buffer B洗脱，按每500 μl一份来收集洗脱产物。
14）用SDS-PAGE的分析结果来确定哪一份洗脱产物中含有目的蛋白。
15）将含有纯化蛋白的洗脱液以Buffer C稀释后，置于透析袋中，在4℃搅拌条件下，梯度透析：
4 M尿素2 M尿素1×PBS＋1 M NaCL l ×PBS+0.5 M NaCL
1 ×PBS 0.5×PBSddH20
16）将透析好的蛋白质留出20 μl用于蛋白含量测定，其余蛋白质冻干后做好标记置于－70℃保存。
Buffer A（pH 7.0）：
50 mM
Na3PO4
&， ， nbsp;
8 M
Urea(尿素)
300 mM
NaCl
Buffer B（pH 7.0）：
45 mM
Na3PO4
7.2 M
Urea(尿素)
270 mM
NaCl
150 mM
咪唑
Buffer C（pH7.0）：
100 mM
NaH2PO4
10 mM
Tris-Cl
8 M
Urea(尿素)
4.2.3 FimA蛋白含量测定
按照BCA法蛋白定量试剂盒操作说明书操作，步骤如下：
1）使用时将Solution A摇晃混匀，根据样品数量，按50体积Solution A加1体积
Solution B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。
2）完全溶解蛋白标准品(5 mg/ml BSA)，取40 μl，用PBS稀释至200 μl ，使终浓度为1 mg/ml 。
3）将稀释后的蛋白标准品(1 mg/ml BSA)按0，5，10，15，20，25，30，35 μl
分别加到96孔板的样品孔中，用PBS将所有标准品补足到40 μl 。
4） 将蛋白样品10 μl加到96孔板的样品孔中，做好标记 ，用PBS稀释到40 μl 。
5）各孔加入200 μl BCA工作液，轻轻用加样枪吹打混匀（注意不要弄出气泡影响读数），37 ℃放置50分钟。
6）冷却到室温后，用酶标仪测定A562的值。
7）根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。
8）重复实验两次，取平均值。
4.2.4 Western blot 鉴定纯化的FimA蛋白
称取适量纯化的His-FimA融合蛋白进行12％的SDS-PAGE，以IPTG诱导后的BL21(DE3)pLysS全菌作为对照，电泳结束后将凝胶切取所需条带部分进行Western blot，具体步骤如3.2.6中所示。
4.3 结果
4.3.1 FimA蛋白的纯化和复性
原核融合表达产物以包涵体的形式存在，经样品制备，Buffer B溶解，过Co2+亲和层析柱，用洗脱Buffer C洗脱，收集管中的洗脱液，取5 μl加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液（Loading Buffer），煮沸10 min，离心后取上清进行SDS-PAGE分析，结果（图4.1）示经洗脱Buffer C洗脱后，洗脱液中基本不含杂蛋白，经这样的纯化过程，可以除去菌体蛋白，得到被纯化的6×His-FimA融合蛋白。
纯化后的融合蛋白经Buffer C稀释后进行梯度透析，以去除尿素等变性剂使蛋白复性。复性完毕的蛋白质做好标记，置于－70℃保存。
图4.1 洗脱蛋白的12% SDS-PAGE电泳分析
1：pET-15b-fimA /BL21(DE3)pLysS；2-18：洗脱液中的蛋白
M：预染蛋白质MarkerⅢ
4.3.2 FimA蛋白定量结果
根据回归曲线（图4.2）算出FimA蛋白样本蛋白浓度为0.96mg/ml，数据见表4-1，4-2。这个结果说明，经Co2+亲和层析，得到的蛋白质的浓度很高。
图4.2 蛋白标准曲线
表4-1 蛋白质标准曲线数据
表4-2 蛋白样品吸光度值
4.3.3 Western blot结果
融合表达的目的蛋白His-FimA带有His标签，因此，6×His-FimA表达产物经SDS-PAGE后，转移至硝酸纤维素膜，以鼠抗6×His Tag单克隆抗体为一抗，采用山羊抗鼠的种属特异性抗体为二抗，ECL底物化学发光试剂盒显色，在X线片上相应位置呈现阳性结果，可见一明显蛋白条带，条带位置与BL21(DE3)pLysS全菌诱导表达后相应蛋白位置一致（图4.3）。Western blot结果进一步证明纯化的蛋白为His-FimA融合蛋白。
1
2
FimA蛋白
图4.3 纯化产物的Western blot鉴定
1：全菌（未纯化）；2：纯化产物
4.4 讨论
在物种进化过程中，为了适应各种不同的生物学功能，蛋白质的结构也变得复杂多样，致使它们的理化特性也大不相同，因此难以使用统一的纯化流程。为此，根据蛋白质的物理特性不同，开发了一系列的纯化方法。其中最为快捷、简便的是亲和色谱法，该方法具有更多选择性，而且只需一、两步即可纯化出目的蛋白质。然而还有很多蛋白质的物理特性没有被充分了解，或者没有找到一些可用于纯化的强结合特性。对于这些问题，解决的方法之一是在目的蛋白质的氨基酸上融合纯化标签，构建一个可以使用普通方法进行纯化的重组蛋白质。
本实验所用原核表达载体pET-15b在大肠杆菌中表达目的蛋白时，是一种融合表达的方式。在载体pET-15b中，T7 RNA聚合酶启动子与多克隆位点之间有编码6个组氨酸的核苷酸序列。本课题组前期实验pMD18-T-fimA双酶切切出的目的基因片段插入到pET-15b多克隆位点中时，插入片段中的fimA基因与编码组氨酸的核苷酸构成了融合基因，当对此融合基因进行表达时，就获得了融合蛋白6×His-FimA蛋白。
在对融合蛋白进行纯化时，我们应用固定化金属螯合亲和层析技术（IMAC）。IMAC通过基团专一性亲和技术来分离蛋白质。其理论基础是氨基酸侧链可与固定化金属离子发生可逆性的相互作用。不同的金属离子可以吸附不同的氨基酸侧链。最为人熟知的是含组氨酸、半胱氨酸和色氨酸侧链的蛋白质可以与固定化的过渡态金属离子结合。
实验中选用美国Clontech实验室的TALON钴离子树脂进行亲和层析。TALON钴离子树脂属于IMAC树脂，以钴作为螯合金属，用来纯化带有组氨酸标签的重组蛋白质。T ALON钴离子树脂对于含组氨酸标签的蛋白质的吸附具有极高的选择性，对宿主蛋白的亲和性极低[119]。实验中，当按照说明书处理过的样品经过TALON钴离子树脂时，没有非特异性蛋白质结合，避免了蛋白质洗脱前繁琐的洗涤过程，大大的节省了实验时间。多聚组氨酸能与多种过渡金属和过渡金属螯合物结合，因此带暴露6×His标签的6×His-FimA融合蛋白能结合于固化Co2+树脂，用适当缓冲液冲洗去除其他蛋白后，再用可溶的竞争性螯合剂洗脱就可以回收靶蛋白。由于咪唑的结构和组氨酸侧链相同，实验过程中，在洗脱缓冲液中加入了咪唑，这样就可以竞争性地将吸附在树脂上的含组氨酸标签的FimA蛋白洗脱下来。
组氨酸可以高选择性地结合某些金属离子，在生理pH条件下，组氨酸的咪唑氮电子云可与过渡态金属的外层电子轨道形成共价键。尽管在一般条件下，只有2～3个组氨酸可以与过渡态金属结合，但是在有强变性剂，比如胍盐（尿素）存在时，则可有6个组氨酸与之稳定结合。这就是常说的6×His标签。在实验一中将重组质粒pET-15b-fimA在大肠杆菌中进行融合表达时，得到的融合蛋白主要以不溶形式存在于包涵体中。在制备样品时，溶解包涵体的缓冲液中加入了8M的尿素，在用钴离子树脂进行亲和层析时，洗脱缓冲液中含有7.2M尿素。在高浓度的变性剂尿素存在时，6×His标签中的六个组氨酸就可以与钴离子稳定结合，更进一步增强了钴离子树脂对FimA蛋白的亲和力，减少了杂蛋白的吸附。
大肠杆菌中合成的融合蛋白通常都是极好的免疫原，可以产生针对靶序列的抗血清。但很多时候，靶序列附加标签会有不利后果，即可能丧失生物活性。目的蛋白只有从融合蛋白上切割下来，才能获得天然的具有生物活性的靶蛋白。6个组氨酸标记物仅增加蛋白分子量0.84 kDa，在多数情况下对目的蛋白的结构和生物活性影响都较小，短小的组氨酸尾巴无免疫原性，因此，在后续实验中，将正确表达后用Co2+柱纯化的FimA蛋白给动物注射用以产生抗体时，无需预先去除组氨酸尾巴。
本实验将实验一的表达产物经Co2+柱亲和层析，得到了带6×His标签的FimA融合蛋白。
5 结论与展望
牙周致病菌侵袭牙周组织时，人体会通过免疫反应影响牙周炎的发生、发展。1925年，Casto首先提出用免疫的方法防治牙周病，但由于龈下菌群的复杂性，使这一研究进展非常缓慢。随着对牙周炎病原菌的分离培养及对牙周炎致病菌的进一步认识，大多数学者把注意力投向Pg这一重要的牙周炎致病菌，并研制出各种类型的牙周炎疫苗。目前关于牙周炎的免疫学研究主要包括主动免疫和被动免疫两个方面。但被动免疫疗效维持时间短又需要长期反复应用，而采用主动免疫则变得简单。主动免疫又分为灭活死疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、多肽疫苗、基因疫苗等。
随着分子生物学技术的发展和成熟，重组载体减毒活疫苗得到越来越多的重视。重组载体减毒活疫苗是指用非致病微生物（细菌或病毒）作为载体呈递外源性抗原的一种减毒活疫苗。目前，细菌载体中研究的较为成熟的有沙门氏菌、卡介苗，其中沙门氏菌是最常用的细菌性载体，至今已有结核杆菌、霍乱弧菌、乙型肝炎病毒、流感病毒和血吸虫等数十种病原微生物的外源基因在以沙门氏菌为载体的减毒活疫苗中获得了不同程度的表达[120]。
这类细菌性重组载体在应用上及技术上有几个显著的特点[120-121]：①制造成本低，可以很方便的大量使用；②使用于人体的途径接近正常感染，尤其是它可以在黏膜局部应用，这就可以诱导具有较好免疫保护作用的黏膜免疫反应；③其外源抗原基因的容量较大，可以携带较大的外源抗原分子；④剔除了许多致病菌产生免疫副反应的产物；⑤易于给药，给药成本也较低。这些优越性使细菌载体疫苗特别适合群体免疫，也适合于牙周病的预防与治疗。
研究重组载体减毒活疫苗，首先要确定其免疫原基因。近年来，随着分子生物学、免疫学、分子细菌学等学科的发展，Pg 的fimA基因已被克隆和测序，对其蛋白质分子中的各个功能区、抗原表位及相应的编码基因片段已有了一定的了解，为研制疫苗提供了可靠的依据。
本课题组在前期实验中成功构建了fimA基因的原核表达质粒pET-15b-fimA。在此基础上，本实验将此质粒在大肠杆菌表达系统表达后，经Co2+柱亲和层析，得到了可用于免疫新西兰大白兔、获得多克隆抗体的FimA蛋白。因此本实验所获得的FimA蛋白为后续实验免疫兔、收集免疫血清而获得多克隆抗体，进一步研制具有实用价值的预防牙周炎的疫苗（如基因工程活载体疫苗、多价联合疫苗）提供了实验基础。
6 全文总结
本研究将本课题组前期实验构建的牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因的原核表达质粒pET-15b-fimA在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达后，经Co2+柱亲和层析，得到以下主要实验结果：
1）经IPTG诱导表达后，工程菌在SDS-PAGE上出现一条新蛋白带，分子量与预期大小基本一致（约41kDa），IPTG浓度及诱导时间对融合蛋白表达量影响较大：当IPTG浓度为2 mmol/L，诱导时间为3 h时蛋白表达量最大；当IPTG浓度为1 mmol/L，诱导时间为1 h时蛋白表达量最小。6×His-FimA表达产物经SDS-PAGE后，转移至硝酸纤维素膜，X线片感光，在X线片上相应位置呈现阳性结果，可见一明显蛋白条带，而空质粒pET-15b对应位置未见特异条带。蛋白表达形式分析结果表明表达的融合蛋白位于包涵体中。
2）表达产物经Co2+柱亲和层析，SDS-PAGE上出现一致的单一条带，其分子量大小与预期相符（约41kDa）。6×His-FimA纯化产物经SDS-PAGE后，转移至硝酸纤维素膜，X线片感光，在X线片上相应位置呈现阳性结果，可见一明显蛋白条带，条带位置与BL21(DE3)pLysS全菌诱导表达后相应蛋白位置一致。经BCA法蛋白浓度定量试剂盒对纯化后的蛋白质进行定量分析，计算出纯化后的FimA蛋白浓度为0.96 mg/ml。
本研究结果说明：用本课题组前期构建的fimA基因的原核表达质粒pET-15b-fimA，在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达后，经Co2+柱亲和层析，可以得到带6×His标签的FimA融合蛋白。这一结果，有助于今后从分子遗传学角度研究牙龈卟啉单胞菌菌毛基因结构与功能的关系和进一步认识其在牙周炎发病过程中的致病机理；同时，为后续实验获得免疫血清和多克隆抗体，以进一步研制具有实用价值的、可预防牙周炎这一口腔常见疾病的免疫疫苗提供了实验基础。
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篇4
【关键词】 毛细管电泳 电化学发光 丙吡胺 血浆蛋白结合率 平衡透析
1 引言
毛细管电泳(capillary electrophoresis,ce)是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分析分离技术［1］，自诞生以来[1]，在蛋白质和多肽［2］、氨基酸[3]、药物[4，5]等分子的分离分析方面显示了强大的应用前景。它具有高效、快速、分析对象广、试剂消耗少、环境友好等优点。因为ce的进样量少，所以需要发展一种与之相匹配的高灵敏度的检测方法。而电化学发光(electrochemiluminescence,ecl)检测正响应了这一需求，它是化学发光和电化学过程的结合，由于其较低的背景信号而使得被分析物的检出限低、线性范围宽[6]。电化学发光体系中采用较多的是三联吡啶钌(ru(bpy)2＋3)反应体系，ru(bpy)2＋3在ecl反应中具有电化学可逆性和较好的稳定性。其ecl同ce联用已应用于药物分析以及药物与蛋白结合作用的研究中[7～10]。
丙吡胺(disopyramide,dp)是一种有效地预防和治疗抗心律失常的药物[11]。对药物蛋白的结合作用的研究有着重要的临床价值，因为游离药物的浓度会影响药物分布以及药物效应[12]。药物蛋白结合率是药物动力学的重要参数之一， 研究药物和蛋白作用的方法主要包括平衡透析、超滤、核磁共振光谱、质谱、色谱、毛细管电泳等方法[13]，其中测定药物游离浓度最常使用的方法是平衡透析[14]。本实验采用传统的平衡透析方法，利用ceecl技术测定了dp对人血浆蛋白的结合率。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
mpia型毛细管电泳电化学发光检测仪(西安瑞迈分析仪器有限公司，中科院长春应用化学研究所)，该仪器由数控毛细管电泳高压电源、多功能化学发光分析仪、电化学分析仪三部分组成，并与计算机联用。本实验使用了50 cm长、内径为25 μm的未涂层的熔融石英毛细管(河北永年光纤厂)。ceecl检测池已有报道[15]。柱端ecl检测池中采用了传统的三电极体系：ф500 μm pt圆盘电极作为工作电极、pt丝为对电极、ag/agcl (饱和kcl)为参比电极。工作电极和毛细管出口端在显微镜下(×40)调整为准直，其距离为125 μm。
ru(bpy)2＋3 (aldrich, 美国milwaukee公司)，丙吡胺（dp，美国sigma公司)。其它试剂均为分析纯。透析袋(8000 da)(上海amersham公司)。实验用水经milliq 系统(美国millipore公司)纯化。用于毛细管电泳所有溶液均放置于4 ℃冰箱，并且进样前先用0.22 μm滤膜(上海新亚净化材料厂)进行过滤。
2.2 实验方法
新毛细管充入1 mol/l naoh浸泡12 h。活化后，毛细管使用前先用0.1 mol/l naoh冲洗10 min，然后用水冲洗10 min，最后用电泳运行缓冲液冲洗10 min。每次实验前，在ecl检测池中加入约600 μl 5 mmol/l ru(bpy)2＋3(配制在50 mmol/l pbs(ph 7.5）中)。ecl信号由mpia系统记录。光电倍增管高压设置为－850 v，恒电位为1.3 v，进样电压为10 kv，进样时间10 s，运行电压为15 kv。运行缓冲液为30 mmol/l pbs(ph 7.5)。
2.3 丙吡胺与血浆的反应
2.3.1 平衡时间的测定 取100 μl 0.01 mol/l dp与90 μl血浆混合，在37 ℃下孵育透析，透析袋外为4 ml 30 mmol/l pbs(ph 7.5)。每隔0.5 h，取100 μl透析袋外的溶液，测定其ecl强度，直到ecl强度达到稳定。
2.3.2 给药量与结合药物量的关系测定 取一系列体积0.05 mol/l dp与90 μl的血浆混合，37 ℃时孵育透析，透析袋外为4 ml pbs 30 mmol/l（ph 7.5)。达到平衡后，分别取透析袋外溶液100 μl测定其ecl强度。
3 结果与讨论
3.1 检测池ph值的优化
对于ceecl检测，许多检测条件如缓冲溶液、检测电位，进样量等都对待测物ecl强度存在影响。其中，检测池ph对ecl信号的强度影响很大，因为ru(bpy)2＋3与共反应物之间的反应依赖于ph，最大ecl峰强通常在稍显碱性的条件下取得[16]。实验考察了柱端检测池中缓冲溶液的ph对ecl强度的影响。dp的浓度为300 μmol/l，运行缓冲溶液为30 mmol/l pbs (ph 7.5)。检测池中为5 mmol/l ru(bpy)2＋3 (配制在50 mmol/l pbs中)，选择ph值从5.2～9.0之间对ph进行优化(见图1)，当ph 5.2～7.0时，ecl信号一直在增加。ph 7.0～7.5时，ecl强度几乎是一个平台。ph＞7.5后，ecl峰强逐渐下降。本实验选择检测池的ph为7.5。
图1 ph 对ecl强度的影响（略）
fig.1 effect of ph on electrochemiluminescence (ecl) intensity
300 μmol/l disapyramide(dp); 电动进样(electrokinetic injection): 10 kv×10 s；分离电压（separation voltage）: 15 kv; 检测电位(detection potential): 1.3 v；运行缓冲液(running buffer): 30 mmol/l pbs, ph 7.5; 检测溶液(detection solution): 5 mmol/l ru(bpy)2＋3溶于50 mmol/l pbs(5 mmol/l ru(bpy)2＋3 in 50 mmol/l pbs)。
由于ru(bpy)2＋3 的氧化电位在1.15 v左右，实验中采用了略高于其氧化电位的1.3 v作为检测电位；实验中发现，ecl强度随ru(bpy)2＋3浓度增加而不断增大，ru(bpy)2＋3浓度达到5 mmol/l并继续增大时，ecl强度趋于饱和，故实验中采用5 mmol/l ru(bpy)2＋3。
3.2 丙吡胺的电泳图
丙吡胺的电泳图如图2所示。以30 mmol/l pbs (ph 7.5)稀释得到了100、300、500、700和1000 μmol/l dp标准溶液。检测池中为5 mmol/l ru(bpy)2+5溶于50 mmol/l pbs (ph 7.5)中，运行缓冲溶液为30 mmol/l pbs (ph 7.5)。dp的出峰时间约6 min，可以看出，随着dp浓度的升高，其峰强逐渐增大。
图2 丙吡胺的电泳图（略）
fig.2 electropherograms of dp
dp (μmol/l): 1. 100； 2. 300； 3. 500； 4. 700； 5. 1000; 其它条件同图1（other conditions were same as fig.1）。
3.3 丙吡胺的线性范围、检出限及重现性
在恒电位1.3 v；进样电压10 kv持续10 s；分离电压15 kv；运行缓冲液30 mmol/l pbs（ph 7.5）；检测池中为5 mmol/l ru(bpy)2＋3 稀释于50 mmol/l pbs中（ph 7.5)，以30 mmol/l pbs（ph 7.5）稀释得到100 μmol/l dp溶液，进样6次测定其峰高与时间的rsd分别为4.94%、0.24%。用30 mmol/l pbs(ph 7.5)配制了一系列标准溶液测定dp的线性范围，得到其线性范围10～1000 μmol/l，线性回归方程为y=78.87+2.34×103x, 其中y为ecl强度，x为dp的浓度；r为0.9947。检出限为10 μmol/l(s/n=3)。
3.4 丙吡胺与血浆蛋白的反应平衡时间的测定
本实验采取平衡透析的方法来研究dp与血浆蛋白间的作用，采用正常人体温37 ℃为反应温度，其达到平衡所需要的时间通过ceecl表征得到。取100 μl 0.01 mol/l dp与90 μl 血浆混合，在37 ℃下孵育透析，透析袋外为4 ml 30 mmol/l pbs (ph 7.5)。每隔0.5或1.0 h，取透析袋外溶液100 μl测定其ecl强度。为了减少仪器带来的误差，每次测透析袋外溶液时先测定250 μmol/l dp溶液(总的ecl强度)，得到的相对ecl强度可以通过为透析袋外dp的ecl强度与总的ecl强度的比值。
如图3所示，随着反应时间的增加，相对ecl强度逐渐增大，大约4 h后，达到一个平台(60%)，表明反应达到平衡。
图3 相对ecl强度随时间的变化（略）
fig.3 relationship between relative ecl intensity and time
孵育温度（incubation temperature）, 37 ℃; 透析袋外溶液(solution inside dialysis bag): 100 μl 0.01 mol/l dp及90 μl血浆蛋白(plasma protein); 透析袋外溶液(solution outside dialysis bag): 4 ml 30 mmol/l pbs (ph 7.5); 其它条件同图1(other conditions were the same as fig.1）。
3.5 丙吡胺结合浓度与血浆中总药浓度之间的关系
取一系列体积的0.05 mol/l dp溶液与90 μl血浆混合，将这一系列透析袋在37 ℃下孵育透析，透析袋外为4 ml 30 mmol/l pbs (ph 7.5)。大约4 h反应平衡后，分别取透析袋外溶液100 μl测定其游离的ecl强度。
在平衡透析的过程中，血浆蛋白以及结合型的药物都不能透过透析袋，只有游离的药物dp才能透过透析袋，所以在达到透析平衡后，透析袋内游离型的药物浓度等于透析袋外游离型药物的浓度。袋内蛋白结合型的dp浓度为药物总量减去游离药物 (即透析袋内游离药物量与透析袋外药物量之和) 的差值除以透析袋内溶液的体积。
药物的血浆蛋白结合率是指血浆中与血浆蛋白结合的结合型药物占血浆中该药物总含量的百分比。
在透析袋中加入不同体积的0.05 mol/l dp和90 μl血浆蛋白,此透析袋浸入4 ml 30 mmol/l pbs (ph 7.5)中，在37 ℃下反应4 h; 取袋外溶液进行ecl测定。
人血浆中dp的浓度为1.6 ～ 8.2 mmol/l时，dp与血浆蛋白的结合是呈线性的，线性回方程为y=0.93x－0.07，其中x为袋内dp的总浓度，y为袋内蛋白结合型dp的浓度。相关系数r为0.9999。dp与血浆蛋白的结合率测定结果见表1，5次测定的平均值为90.4%，即dp与人血浆蛋白的结合率为90.4%。
表1 丙吡胺与人血浆蛋白结合率测定结果（略）
table 1 protein binding rate of disopyramide with human plasma protein
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