白猫计划范文
时间：2022-08-31 05:30:00
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篇1
我在近20年前写作《全球化是否过犹不及》（Has Globalization Gone Too Far？）一书时，曾经请一位著名经济学家撰写推荐跋。我在书中说，如果没有更加协调的政府应对机制，过度全球化将深化社会分裂，加剧分配问题，破坏国内社会契约―该书出版后，这些观点都成为常规智慧。
这位经济学家对此持有异议。他说，他并不真的反对其中的分析，但是担心我的书会“为野蛮人提供火力”。保护主义者会抓住书中关于全球化弊端的论点，为他们的狭隘自私的日程提供支持。
我们的观点被我们所反对的人在公共辩论中劫持，这样的风险永远存在。但我始终不明白，为何许多经济学家认为这意味着我们应该让我们的贸易观点呈现出一边倒的状况。潜在的假设似乎是，野蛮人只存在于贸易争论的一边。显然，他们认为抱怨世界贸易组织或贸易协定的人是可怕的保护主义者，而那些支持世贸组织和贸易协定的人永远是天使。
事实上，许多贸易支持者也完全是出于自身狭隘自私的日程。制药企业追求更严格的专利规则，银行推动外国市场的完全开放，寻求特别仲裁法庭的跨国公司对公共利益的关心绝不会比保护主义者多。因此，当经济学家遮掩观点时，他们实际上是为了躲避一群野蛮人而便利了另一群野蛮人。
对经济学家来说，有一个存在已久的不成文的公共参与规则，即他们应该站出来支持贸易，不要扭扭捏捏。这造成了一个有趣的局面。经济学家日常使用的标准贸易模型，常常会产生剧烈的分配效应：某个生产者或工人群体收入损失，另一些人“从贸易中获益”，此乃同一枚硬币的两面。经济学家早就知道市场失灵―包括劳动力市场功能失调、信用市场不完美、知识和环境外部性、垄断等―可能起到干扰作用，让这些好处无法获得。
他们还知道，影响国内监管的跨境贸易协定的经济收益，比如收紧专利规则或调和健康与安全要求，从根本上是模棱两可的。
尽管如此，凡是有贸易协定出台，人们永远希望经济学家高举比较优势和自由贸易的大旗。他们一直在尽量减小分配顾虑，即使如今已经十分清楚，（比如）北美自由贸易协定或中国加入世贸组织的收益效应，对于美国最直接的受影响群体而言是非常大的。他们过分强调来自贸易协议的总收益，尽管这些收益至少从20世纪90年代以来已经相对较小。他们大力渲染今天的贸易协议是“自由贸易协定”，哪怕亚当・斯密和大卫・李嘉图看到跨太平洋合作伙伴协定的话肯定会气得从坟墓里站起来。
经济学家不愿意在贸易问题上说实话，这导致他们在公众面前失去信誉。更糟糕的是，这有利于他们的反对者的话语权。经济学家没有提供完整的贸易图景，没有说明白必不可少的区分和警告，这让贸易的各种副作用更加容易被错误地渲染。
比如，贸易固然可能导致不平等性加剧，但它只是推动这一广泛趋势的因素之一―并且其作用远远不如科技。如果经济学家能够预先普及贸易的弊端，他们本应在这场争论中拥有更高的信誉，被视为诚实的真理代言人。
篇2
1引言
转铁蛋白（Trf）是脊椎动物体中一种非血红素结合铁的馇虻鞍祝捎胂赴ど系rf受体结合，内吞化形成内吞小体。在特定信号介导下，Trf可以通过释放铁离子，转移出细胞膜外。由于恶性肿瘤细胞过度表达Trf受体，因此，通过标记Trf可进行肿瘤细胞的识别、诊断和治疗研究[1，2]。量子点作为一种新型荧光材料，近年来在生物成像研究中快速发展，特别是在细胞可视化研究方面[3～11]。量子点用于细胞标记一般需将量子点与靶蛋白偶联，再通过靶蛋白结合在细胞膜或进入胞内显示量子点的荧光，由此进行靶蛋白在细胞膜及胞内的定位及成像分析。因此靶蛋白与量子点的偶联体系的构建是量子点生物成像应用的基础。
本研究选取Trf为靶蛋白，通过其与细胞膜上的Trf受体结合，进而转运靶蛋白量子点的偶联物。目前，量子点与蛋白质的偶联多采用生物素亲和素法、共价法及静电吸附法等。蛋白质与量子点偶联时，二者的混合比例决定偶联产物的质量以及生物功能化的效果。在量子点与蛋白质的偶联反应中建立高效、快速、低成本方法进行表征，对于偶联体系的优化，提高偶联效率非常必要。本研究利用毛细管电泳激光诱导荧光法（CELIF）的高效、快速、高灵敏和样品用量少等优势，对Trf与量子点CdTe偶联的方法和条件进行快速优化，并将得到的CdTeTrf偶联物不经分离而直接用于Hela细胞标记。通过激光共聚焦显微镜进行标记效果的成像观察。实验结果表明， CdTeTrf偶联物具有Trf的生物功能，并能特异性识别细胞膜表面的Trf受体，在其介导下可转运到Hela细胞内，分布在胞质中。CELIF法也适用于其它荧光纳米材料的表面功能化效率表征，包括偶联剂种类的选择和反应比例的优化、偶联产物的性质表征等，具有一定的通用性。
3结果与讨论
采用CELIF进行偶联条件优化可得到偶联产物的定性与定量信息，如荷电性质、荷质比、荧光强度、稳定性等，有助于最佳条件的判断和选择。
3.1偶联剂活化后量子点的表征
因所用量子点是以巯基乙酸为稳定剂在水相中合成而得，故量子点表面包覆着一层羧基，而量子点与Trf的偶联则通过量子点表面的羧基与蛋白质表面的氨基间的酰胺反应完成。NHS和EDC为常用的亚胺偶联剂，实验中对比了以NHS及NHS和EDC混合偶联剂（EDCNHS）活化的量子点性能（图1）。
由图1a可见，以单一偶联剂NHS活化的量子点其荧光强度高且峰形尖锐，说明单一偶联剂NHS活化的量子点粒径均一，有利于减少量子点表面缺陷，增强量子点荧光效率。当使用混合偶联剂活化时，量子点的峰形较宽，峰强度较低（图1b），说明混合偶联剂可能导致量子点的稳定性降低，量子点间产生一定程度的团聚。导致其峰高降低，峰展宽。对比图1a和图1b可见，单一偶联剂NHS活化后量子点性能好于混合偶联剂EDCNHS活化的量子点。因此后续实验均采用NHS偶联剂对量子点进行活化[12，14]。
3.2量子点偶联Trf的条件优化
NHS的存在使Trf可有效的偶联于CdTe表面，形成类似核壳结构的CdTeTrf偶联产物。由图2A第一个电泳图可见，产物峰（3.3 min）相对于活化后的CdTe（图1a， 6.3 min）迁移时间缩短，即量子点偶联蛋白后迁移加快，说明Trf确实已偶联于CdTe表面，且偶联产物表面电荷性质以及整体的荷质比更接近于蛋白质的迁移时间（约3.0 min）。因此说明不同Trf浓度下形成的偶联产物均以CdTe为核，以Trf为壳，呈现为核壳复合物。
随偶联蛋白Trf浓度的增加，偶联产物的荧光强度变化如图2B。当Trf的浓度低于31.2 olL时，随Trf的浓度增加，偶联产物荧光强度明显增强。说明包覆于表面的Trf对CdTe表面的晶格缺陷有所改善。Trf的包覆量越多，CdTe表面越完善，荧光强度越高。但当Trf浓度高于31.2 olL，荧光强度转而开始下降。说明偶联反应在31.2 olL时已达饱和，CdTe表面完全被Trf包覆，而溶液中过量的游离Trf不仅对功能化的量子点有一定的荧光猝灭作用，而且在后续偶联体系标记细胞时，游离的Trf将与偶联产物CdTeTrf一起竞争细胞上的Trf受体靶标，严重干扰CdTeTrf对细胞表面Trf受体的标记。因此，采用CELIF法对量子点偶联条件进行优化，简单快速，可明确判断蛋白质是否偶联于量子点表面，更有利于严格控制Trf与CdTe的反应比例，提高偶联效率和细胞标记效果，后续标记时不需要对偶联体系的产物进行分离纯化。由于Trf浓度增高，会使溶液粘度增加，导致电泳峰展宽，因此采用峰面积考察荧光强度变化。
篇3
本实验用本课题组前期构建的fimA基因的原核表达质粒pET-15b-fimA，在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达后，fimA基因得到正确表达。
4 实验二 FimA蛋白的纯化与鉴定
4.1 实验材料与仪器
4.1.1 菌珠
携带有pET-15b Vector和pET-15b-fimA的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS：实验一获得。
4.1.2 主要试剂
1）BCA法蛋白定量试剂盒：碧云天公司
2）TALON纯化试剂盒：Clontech Laboratories，Inc，USA
3）其他：同实验一
4.1.3 实验仪器
1）宝特ELX-800酶标仪：宝特仪器有限公司
2）其他：同实验一
4.2 实验方法 4.2.1 样品制备
按照TALON纯化试剂盒操作说明书制备样品，步骤如下：
1）在转化了质粒pET-15b-fimA的LB固体培养基上，用接种环挑取阳性克隆菌落，接种于5 ml Amp+(100 μg/ml)的LB培养液中，37℃振摇过夜。
2）将5 ml过夜菌转接于500 ml LB(Amp+)培养液中，37℃振摇4 h；加入IPTG致终浓度为2 mmol/L ，37℃振摇3 h。
3）4℃，5500 r/min离心20 min收集细菌沉淀，弃上清，沉淀置于冰上或－20℃保存。
4）用Buffer A（pH 7.0）重悬细胞沉淀物，每25 ml细胞培养物使用2 ml缓冲液。
5）轻轻振荡样品直到它变得半透明为止。
6）4℃，10000～12000 r/min离心20 min以去除不溶性杂质。
7）小心的转移上清液到一个干净的离心管，不要触动沉淀物。离心管中的澄清的上清液就是样品了。
4.2.2 分批/重力流柱子纯化FimA蛋白
按照TALON纯化试剂盒操作说明书进行，步骤如下：
1）彻底重悬TALON树脂。
2）快速转移3 ml树脂悬液入一个无菌的离心管，700 g离心2 min，弃上清。
3） 加入10倍柱床体积的Buffer A（pH 7.0），小心混匀以平衡树脂，700 g离心2 min，弃上清。
4）重复步骤3。
5）加入4.2.1所制备的样品。
6）室温下，小心搅拌上一步所得混合液20 min，700 g离心5 min。
7）小心移除尽可能多的上清液，注意不要触碰到沉淀在离心管底的树脂。
8）用10～20柱床体积的Buffer A（pH 7.0）冲洗树脂。室温下，小心搅拌悬液10 min，以达到更彻底的冲洗效果，700 g离心5 min，弃上清。
9）重复步骤8。
10）加入1倍柱床体积的Buffer A（pH 7.0），重悬混合。
11）转移树脂到一个2 ml的重力流层析柱中，缓冲液从层析柱底部引流出来直至到达柱床顶部，该过程中要确保树脂柱床中不能有气泡进入。
12）用五倍柱床体积的加入了8 mM的咪唑的Buffer A（pH 7.0）冲洗柱子。
13）加入5倍柱床体积的Buffer B洗脱，按每500 μl一份来收集洗脱产物。
14）用SDS-PAGE的分析结果来确定哪一份洗脱产物中含有目的蛋白。
15）将含有纯化蛋白的洗脱液以Buffer C稀释后，置于透析袋中，在4℃搅拌条件下，梯度透析：
4 M尿素2 M尿素1×PBS＋1 M NaCL l ×PBS+0.5 M NaCL
1 ×PBS 0.5×PBSddH20
16）将透析好的蛋白质留出20 μl用于蛋白含量测定，其余蛋白质冻干后做好标记置于－70℃保存。
Buffer A（pH 7.0）：
50 mM
Na3PO4
&， ， nbsp;
8 M
Urea(尿素)
300 mM
NaCl
Buffer B（pH 7.0）：
45 mM
Na3PO4
7.2 M
Urea(尿素)
270 mM
NaCl
150 mM
咪唑
Buffer C（pH7.0）：
100 mM
NaH2PO4
10 mM
Tris-Cl
8 M
Urea(尿素)
4.2.3 FimA蛋白含量测定
按照BCA法蛋白定量试剂盒操作说明书操作，步骤如下：
1）使用时将Solution A摇晃混匀，根据样品数量，按50体积Solution A加1体积
Solution B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。
2）完全溶解蛋白标准品(5 mg/ml BSA)，取40 μl，用PBS稀释至200 μl ，使终浓度为1 mg/ml 。
3）将稀释后的蛋白标准品(1 mg/ml BSA)按0，5，10，15，20，25，30，35 μl
分别加到96孔板的样品孔中，用PBS将所有标准品补足到40 μl 。
4） 将蛋白样品10 μl加到96孔板的样品孔中，做好标记 ，用PBS稀释到40 μl 。
5）各孔加入200 μl BCA工作液，轻轻用加样枪吹打混匀（注意不要弄出气泡影响读数），37 ℃放置50分钟。
6）冷却到室温后，用酶标仪测定A562的值。
7）根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。
8）重复实验两次，取平均值。
4.2.4 Western blot 鉴定纯化的FimA蛋白
称取适量纯化的His-FimA融合蛋白进行12％的SDS-PAGE，以IPTG诱导后的BL21(DE3)pLysS全菌作为对照，电泳结束后将凝胶切取所需条带部分进行Western blot，具体步骤如3.2.6中所示。
4.3 结果
4.3.1 FimA蛋白的纯化和复性
原核融合表达产物以包涵体的形式存在，经样品制备，Buffer B溶解，过Co2+亲和层析柱，用洗脱Buffer C洗脱，收集管中的洗脱液，取5 μl加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液（Loading Buffer），煮沸10 min，离心后取上清进行SDS-PAGE分析，结果（图4.1）示经洗脱Buffer C洗脱后，洗脱液中基本不含杂蛋白，经这样的纯化过程，可以除去菌体蛋白，得到被纯化的6×His-FimA融合蛋白。
纯化后的融合蛋白经Buffer C稀释后进行梯度透析，以去除尿素等变性剂使蛋白复性。复性完毕的蛋白质做好标记，置于－70℃保存。
图4.1 洗脱蛋白的12% SDS-PAGE电泳分析
1：pET-15b-fimA /BL21(DE3)pLysS；2-18：洗脱液中的蛋白
M：预染蛋白质MarkerⅢ
4.3.2 FimA蛋白定量结果
根据回归曲线（图4.2）算出FimA蛋白样本蛋白浓度为0.96mg/ml，数据见表4-1，4-2。这个结果说明，经Co2+亲和层析，得到的蛋白质的浓度很高。
图4.2 蛋白标准曲线
表4-1 蛋白质标准曲线数据
表4-2 蛋白样品吸光度值
4.3.3 Western blot结果
融合表达的目的蛋白His-FimA带有His标签，因此，6×His-FimA表达产物经SDS-PAGE后，转移至硝酸纤维素膜，以鼠抗6×His Tag单克隆抗体为一抗，采用山羊抗鼠的种属特异性抗体为二抗，ECL底物化学发光试剂盒显色，在X线片上相应位置呈现阳性结果，可见一明显蛋白条带，条带位置与BL21(DE3)pLysS全菌诱导表达后相应蛋白位置一致（图4.3）。Western blot结果进一步证明纯化的蛋白为His-FimA融合蛋白。
1
2
FimA蛋白
图4.3 纯化产物的Western blot鉴定
1：全菌（未纯化）；2：纯化产物
4.4 讨论
在物种进化过程中，为了适应各种不同的生物学功能，蛋白质的结构也变得复杂多样，致使它们的理化特性也大不相同，因此难以使用统一的纯化流程。为此，根据蛋白质的物理特性不同，开发了一系列的纯化方法。其中最为快捷、简便的是亲和色谱法，该方法具有更多选择性，而且只需一、两步即可纯化出目的蛋白质。然而还有很多蛋白质的物理特性没有被充分了解，或者没有找到一些可用于纯化的强结合特性。对于这些问题，解决的方法之一是在目的蛋白质的氨基酸上融合纯化标签，构建一个可以使用普通方法进行纯化的重组蛋白质。
本实验所用原核表达载体pET-15b在大肠杆菌中表达目的蛋白时，是一种融合表达的方式。在载体pET-15b中，T7 RNA聚合酶启动子与多克隆位点之间有编码6个组氨酸的核苷酸序列。本课题组前期实验pMD18-T-fimA双酶切切出的目的基因片段插入到pET-15b多克隆位点中时，插入片段中的fimA基因与编码组氨酸的核苷酸构成了融合基因，当对此融合基因进行表达时，就获得了融合蛋白6×His-FimA蛋白。
在对融合蛋白进行纯化时，我们应用固定化金属螯合亲和层析技术（IMAC）。IMAC通过基团专一性亲和技术来分离蛋白质。其理论基础是氨基酸侧链可与固定化金属离子发生可逆性的相互作用。不同的金属离子可以吸附不同的氨基酸侧链。最为人熟知的是含组氨酸、半胱氨酸和色氨酸侧链的蛋白质可以与固定化的过渡态金属离子结合。
实验中选用美国Clontech实验室的TALON钴离子树脂进行亲和层析。TALON钴离子树脂属于IMAC树脂，以钴作为螯合金属，用来纯化带有组氨酸标签的重组蛋白质。T ALON钴离子树脂对于含组氨酸标签的蛋白质的吸附具有极高的选择性，对宿主蛋白的亲和性极低[119]。实验中，当按照说明书处理过的样品经过TALON钴离子树脂时，没有非特异性蛋白质结合，避免了蛋白质洗脱前繁琐的洗涤过程，大大的节省了实验时间。多聚组氨酸能与多种过渡金属和过渡金属螯合物结合，因此带暴露6×His标签的6×His-FimA融合蛋白能结合于固化Co2+树脂，用适当缓冲液冲洗去除其他蛋白后，再用可溶的竞争性螯合剂洗脱就可以回收靶蛋白。由于咪唑的结构和组氨酸侧链相同，实验过程中，在洗脱缓冲液中加入了咪唑，这样就可以竞争性地将吸附在树脂上的含组氨酸标签的FimA蛋白洗脱下来。
组氨酸可以高选择性地结合某些金属离子，在生理pH条件下，组氨酸的咪唑氮电子云可与过渡态金属的外层电子轨道形成共价键。尽管在一般条件下，只有2～3个组氨酸可以与过渡态金属结合，但是在有强变性剂，比如胍盐（尿素）存在时，则可有6个组氨酸与之稳定结合。这就是常说的6×His标签。在实验一中将重组质粒pET-15b-fimA在大肠杆菌中进行融合表达时，得到的融合蛋白主要以不溶形式存在于包涵体中。在制备样品时，溶解包涵体的缓冲液中加入了8M的尿素，在用钴离子树脂进行亲和层析时，洗脱缓冲液中含有7.2M尿素。在高浓度的变性剂尿素存在时，6×His标签中的六个组氨酸就可以与钴离子稳定结合，更进一步增强了钴离子树脂对FimA蛋白的亲和力，减少了杂蛋白的吸附。
大肠杆菌中合成的融合蛋白通常都是极好的免疫原，可以产生针对靶序列的抗血清。但很多时候，靶序列附加标签会有不利后果，即可能丧失生物活性。目的蛋白只有从融合蛋白上切割下来，才能获得天然的具有生物活性的靶蛋白。6个组氨酸标记物仅增加蛋白分子量0.84 kDa，在多数情况下对目的蛋白的结构和生物活性影响都较小，短小的组氨酸尾巴无免疫原性，因此，在后续实验中，将正确表达后用Co2+柱纯化的FimA蛋白给动物注射用以产生抗体时，无需预先去除组氨酸尾巴。
本实验将实验一的表达产物经Co2+柱亲和层析，得到了带6×His标签的FimA融合蛋白。
5 结论与展望
牙周致病菌侵袭牙周组织时，人体会通过免疫反应影响牙周炎的发生、发展。1925年，Casto首先提出用免疫的方法防治牙周病，但由于龈下菌群的复杂性，使这一研究进展非常缓慢。随着对牙周炎病原菌的分离培养及对牙周炎致病菌的进一步认识，大多数学者把注意力投向Pg这一重要的牙周炎致病菌，并研制出各种类型的牙周炎疫苗。目前关于牙周炎的免疫学研究主要包括主动免疫和被动免疫两个方面。但被动免疫疗效维持时间短又需要长期反复应用，而采用主动免疫则变得简单。主动免疫又分为灭活死疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、多肽疫苗、基因疫苗等。
随着分子生物学技术的发展和成熟，重组载体减毒活疫苗得到越来越多的重视。重组载体减毒活疫苗是指用非致病微生物（细菌或病毒）作为载体呈递外源性抗原的一种减毒活疫苗。目前，细菌载体中研究的较为成熟的有沙门氏菌、卡介苗，其中沙门氏菌是最常用的细菌性载体，至今已有结核杆菌、霍乱弧菌、乙型肝炎病毒、流感病毒和血吸虫等数十种病原微生物的外源基因在以沙门氏菌为载体的减毒活疫苗中获得了不同程度的表达[120]。
这类细菌性重组载体在应用上及技术上有几个显著的特点[120-121]：①制造成本低，可以很方便的大量使用；②使用于人体的途径接近正常感染，尤其是它可以在黏膜局部应用，这就可以诱导具有较好免疫保护作用的黏膜免疫反应；③其外源抗原基因的容量较大，可以携带较大的外源抗原分子；④剔除了许多致病菌产生免疫副反应的产物；⑤易于给药，给药成本也较低。这些优越性使细菌载体疫苗特别适合群体免疫，也适合于牙周病的预防与治疗。
研究重组载体减毒活疫苗，首先要确定其免疫原基因。近年来，随着分子生物学、免疫学、分子细菌学等学科的发展，Pg 的fimA基因已被克隆和测序，对其蛋白质分子中的各个功能区、抗原表位及相应的编码基因片段已有了一定的了解，为研制疫苗提供了可靠的依据。
本课题组在前期实验中成功构建了fimA基因的原核表达质粒pET-15b-fimA。在此基础上，本实验将此质粒在大肠杆菌表达系统表达后，经Co2+柱亲和层析，得到了可用于免疫新西兰大白兔、获得多克隆抗体的FimA蛋白。因此本实验所获得的FimA蛋白为后续实验免疫兔、收集免疫血清而获得多克隆抗体，进一步研制具有实用价值的预防牙周炎的疫苗（如基因工程活载体疫苗、多价联合疫苗）提供了实验基础。
6 全文总结
本研究将本课题组前期实验构建的牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因的原核表达质粒pET-15b-fimA在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达后，经Co2+柱亲和层析，得到以下主要实验结果：
1）经IPTG诱导表达后，工程菌在SDS-PAGE上出现一条新蛋白带，分子量与预期大小基本一致（约41kDa），IPTG浓度及诱导时间对融合蛋白表达量影响较大：当IPTG浓度为2 mmol/L，诱导时间为3 h时蛋白表达量最大；当IPTG浓度为1 mmol/L，诱导时间为1 h时蛋白表达量最小。6×His-FimA表达产物经SDS-PAGE后，转移至硝酸纤维素膜，X线片感光，在X线片上相应位置呈现阳性结果，可见一明显蛋白条带，而空质粒pET-15b对应位置未见特异条带。蛋白表达形式分析结果表明表达的融合蛋白位于包涵体中。
2）表达产物经Co2+柱亲和层析，SDS-PAGE上出现一致的单一条带，其分子量大小与预期相符（约41kDa）。6×His-FimA纯化产物经SDS-PAGE后，转移至硝酸纤维素膜，X线片感光，在X线片上相应位置呈现阳性结果，可见一明显蛋白条带，条带位置与BL21(DE3)pLysS全菌诱导表达后相应蛋白位置一致。经BCA法蛋白浓度定量试剂盒对纯化后的蛋白质进行定量分析，计算出纯化后的FimA蛋白浓度为0.96 mg/ml。
本研究结果说明：用本课题组前期构建的fimA基因的原核表达质粒pET-15b-fimA，在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达后，经Co2+柱亲和层析，可以得到带6×His标签的FimA融合蛋白。这一结果，有助于今后从分子遗传学角度研究牙龈卟啉单胞菌菌毛基因结构与功能的关系和进一步认识其在牙周炎发病过程中的致病机理；同时，为后续实验获得免疫血清和多克隆抗体，以进一步研制具有实用价值的、可预防牙周炎这一口腔常见疾病的免疫疫苗提供了实验基础。
参考文献
[1]Maeda K， Nagata H， yamamoto Y，et al. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase of streptococcus oralis functions as a coadhesin for Porphyromonas gingivalis major fimbriae [J].Infect Immun，2004，72(3):1341-1348.
[2]Goulbourne PA，Ellen RP. Evidence that Porphyromonas (Bacteroides) gingivalis fimbriae function in adhesion to actinomyces viscosus [J].J Baeteriol， 1991， 173(17):5266-5274.
[3] 黄定明，周学东，天野敦雄.牙龈卟啉单胞菌菌毛FimA与福赛斯类杆菌表面蛋白间相互结合机制[J].牙体牙髓牙周病学杂志，2004，14(6):302-305.
[4] Ogawa T， Uchida H， and Hamada S.Porphyromonas gingivalis fimbriae and their synthetic peptides induce proinflammatory cytokines in human peripheral blood monocyte cultures [J].FEMS Microbiol Lett， 1994， 116(2):237-242.
[5] Deslauriers M，Haque S，Flood PM.Identification of murine protective epitopes on the Porphyromonas gingivalis fimbrillin molecule[J].Infect Immun，1996，64(2):434-440
[6] Isogai H，Isogai E，Yoshimura F，et al.Specific inhibition of adherence of an oral strain of Bacteroides gingivalis 381 to epithelial cells by monoclonal antibodies against the bacterial fimbriae[J].Arch Oral Biol，1988，33(7):479-485.
[7] 曹采芳. 牙周病学[M]. 人民卫生出版社2000. 3，38，44.
[8] Missailidis CG， Umeda JE， Ota-Tsuzuki C， et al. Distribution of fimA genotypes of Porphyromonas gingivalis in subjects with various periodontal conditions. Oral Microbiol Immunol， 2004， 19(4):224-9.
[9]Chun YH， Chun KR， Olguin D， et al. Biological foundation for periodontitis as a potential risk factor for atherosclerosis. J Periodontal Res， 2005， 40(1):87-95.
[10] Pussinen PJ， Mattila K. Periodontal infections and atherosclerosis: mere associations.Curr Opin Lipidol， 2004， 15(5):583-8.
[11] Paquette DW. The periodontal-cardiovascular link. Compend Contin Educ Dent， 2004， 25 (9): 681-2， 685-92.
[12] Buduneli N， Baylas H， Buduneli E， et al. Periodontal infections and pre-term low birth weight: a case-control study. J Clin Periodontol， 2005， 32(2):174-81.
[13] Umemoto T， Hamada N. Characterization of biologically active cell surface components of a periodontal pathogen. The roles of major and minor fimbriae of Porphyromonas gingivalis. J Periodontol， 2003， 74(1):119-22.
[14] Hamada N， Watanabe K， Sasakawa C， et al. Construction and characterization of a fimA mutant of Porphyromonas gingivalis. Infect Immun， 1994， 62(5):1696-704.
[15] Umemoto T， Hamada N. Characterization of biologically active cell surface components of a periodontal pathogen. The roles of major and minor fimbriae of Porphyromonas gingivalis. J Periodontol， 2003， 74(1):119-22.
[16] Deshpande RG， Khan MB， Genco CA. Invasion of aortic and heart endothelial cells by Porphyromonas gingivalis. Infect Immun， 1998， 66(11):5337-43.
[17] Jotwani R， Cutler CW. Fimbriated Porphyromonas gingivalis is More Efficient than Fimbria-Deficient P. gingivalis in Entering Human Dendritic Cells in Vitro and Induces an Inflammatory Th1 Effector Response. Infect Immun， 2004， 72(3):1725-32.
[18] Lee JY， Sojar HT， Bedi GS， et al. Synthetic peptides analogous to the fimbrillin sequence inhibit adherence of Porphyromonas gingivalis. Infect Immun， 1992， 60(4):1662-70. [19]Malek R， Fisher JG， Caleca A， et al. Inactivation of the Porphyromonas gingivalis fimA gene blocks periodontal damage in gnotobiotic rats. J Bacteriol， 1994， 176(4):1052-9.
[20]Kinder SA， Holt SC. Localization of the Fusobacterium nucleatum T18 adhesin activity mediating coaggregation with Porphyromonas gingivalis T22. J Bacteriol， 1993， 175(3): 840-50.
[21] Iwamura T， Caffrey TC， Kitamura N， et al. P-selectin expression in a metastatic pancreatic tumor cell line(SUIT-2). Cancer Res， 1997， 57:206.
[22] Hajishengallis G， Sojar H， Genco RJ， et al. Intracellular signaling and cytokine induction upon interactions of Porphyromonas gingivalis fimbriae with pattern-recognition receptors. Immunol Invest， 2004， 33(2):157-72.
[23] Evans RT， Klausen B， Genco RJ. Immunization with fimbrial protein and peptide protects against Porphyromonas gingivalis-induced periodontal tissue destruction. Adv Exp Med Biol， 1992， 327:255-62.
[24] Jotwani R， Cutler CW. Fimbriated Porphyromonas gingivalis is More Efficient than Fimbria-Deficient P. gingivalis in Entering Human Dendritic Cells in Vitro and Induces an Inflammatory Th1 Effector Response. Infect Immun， 2004， 72(3):1725-32.
[25] Amano A， Sojar HT， Lee JY， et al. Salivary receptors for recombinant fimbrillin of Porphyromonas gingivalis. Infect Immun， 1994， 62(8):3372-80.
[26] Condorelli F， Scalia G， Cali G， et al. Isolation of Porphyromonas gingivalis and detection of immunoglobulin A specific to fimbrial antigen in gingival crevicular fluid. J Clin Microbiol， 1998， 36(8):2322-5.
[27] Yanagita M， Hiroi T， Kitagaki N， et al. Nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissue (NALT) immunity: fimbriae-specific Th1 and Th2 cell-regulated IgA responses for the inhibition of bacterial attachment to epithelial cells and subsequent inflammatory cytokine production. J Immunol， 1999， 162(6):3559-65.
[28] Giacona MB， Papapanou PN， Lamster IB， et al. Porphyromonas gingivalis induces its uptake by human macrophages and promotes foam cell formation in vitro. FEMS Microbiol Lett， 2004， 241(1):95-101.
[29]Mikio S， Mariko N， Hideharu Y， et al. The major structural components of two cell surface filaments of Porphyromonas gingivalis are matured through lipoprotein precursors. Mol Microbio， 2004， 52(5)， 1513–1525.
[30] Calkins CC， Platt K， Potempa J， et al. Inactivation of tumor necrosis factor-alpha by proteinases (gingipains) from the periodontal pathogen， Porphyromonas gingivalis. Implications of immune evasion. J Biol Chem， 1998， 273(12):6611-6614.
[31] Fedi PF Jr， Killoy WJ. Temperature differences at periodontal sites in health and disease. J Periodontol， 1992， 63(1):24-7.
[32] Xie H， Chung WO， Park Y， et al. Regulation of the Porphyromonas gingivalis fimA (Fimbrillin) gene. Infect Immun， 2000， 68(12):6574-9.
[33] Amano A， Shamra A， Sojar HT， et al. Effects of temperature stress on expression of fimbriae and superoxide dismutase by Porphyromonas gingivalis. Infect Immun， 1994， 62 (10):4682-4685.
[34] Murakami Y， Masuda T， Imai M， et al. Analysis of Major Virulence Factors in Porphyromonas gingivalis under Various Culture Temperatures Using Specific Antibodies Microbiol Immunol， 2004， 48(8):561-9.
[35]Amano A， Premaraj T， Kuboniwa M， et al. Altered antigenicity in periodontitis patients and decreased adhesion of Porphyromonas gingivalis by environmental temperature stress.Oral Microbiol Immunol， 2001， 16(2):124-8.
[36] Jordi BJ， Dagberg B， de Haan LA， et al. The positive regulator CfaD overcomes the repression mediated by histone-like protein H-NS (H1) in the CFA/I fimbrial operon of Escherichia coli. EMBO J， 1992， 11(7):2627-2632.
[37] Pruss G J， Drlica K. DNA supercoiling and prokaryotic transcription. Cell， 1989， 56(4): 521- 523.
[38] Xie H， Cai S， Iamout RJ. Environmental regulation of fimbrial gene expression in Porphyromonas gingivalis. Infect Immun， 1997， 65(6):2265-2271.
[39] Olczak T， Simpson W， Liu X， et al. Iron and heme utilization in Porphyromonas gingivalis. FEMS Microbiol Rev， 2005， 29(1):119-44.
[40] McKee AS， McDermid AS， Baskerville A， et al. Effect of hemin on the physiology and virulence of Bacteroides gingivalis W50. Infect Immun， 1986， 52(2):349-355.
[41] Jenkinson HF， Demuth DR. Structure， function and immunogenicity of streptococcal antigen I/II polypeptides. Mol Microbiol， 1997， 23(2):183-190.
[42] Bramanti TE， Holt SC， Ebersole JL， et al. Regulation of Porphyromonas gingivalis virulence: hemin limitation effects on the outer membrane protein (OMP) expression and biological activity. J Periodontal Res， 1993， 28:464-466.
[43] Genco CA， Simpson W， Forng RY， et al. Characterization of a Tn4351-generated hemin uptake mutant of Porphyromonas gingivalis: evidence for the coordinate regulation of virulence factors by hemin. Infect Immun， 1995， 63(7):2459-2466.
[44] Litwin CM， Calderwood SB. Role of iron in regulation of virulence genes. Clin Microbiol Rev， 1993， 6(2):137-149.
[45] Hayashi J， Nishikawa K， Hirano R， et al. Identification of a two-component signal transduction system involved in fimbriation of Porphyromonas gingivalis. Microbiol. Immunol， 2000， 44:279-282.
46]Kiyoshi N， Fuminobu Y， Margaret J. A regulation cascade controls expression of Porphyromonas gingivalis fimbriae via the FimR response regulator. Mol Microbiol， 2004， 54(2)， 546–560.
[47] Xie H， Kozlova N， Lamont RJ. Porphyromonas gingivalis genes involved in fimA regulation. Infect Immun， 2004， 72(2):651-8.
[48]Xie H， Lamont RJ. Promoter architecture of the Porphyromonas gingivalis fimbrillin gene. Infect Immun，1999， 67(7):3227-3235.
[49]Xie H， Cook GS， Costerton JW， et al. Intergeneric communication in dental plaque biofilms. J Bacteriol， 2000， 182(24):7067-7069.
[50] Busby S， Ebright RH. Promoter structure， promoter recognition， and transcription activation in prokaryotes. Cell， 1994， 79(5):743-746.
[51] Nakayama K， Yoshimura F， Kadowaki T， et al. Involvement of arginine-specific cysteine proteinase (Arg-gingipain) in fimbriation of Porphyromonas gingivalis. J Bacteriol， 1996， 178(10):2818-2824.
[52] Park Y， Iamont RJ. Contact-dependent protein secretion in Porphyromonas gingivalis. Infect Immun， 1998， 66(10):4777-4782.
[53] Tokuda M， Karunakaran T， Duncan M， et al. Role of Arg-gingipain A in virulence of Porphyromonas gingivalis. Infect Immun， 1998， 66(3):1159-1166.
[54]Dickinson DP， Kubiniec MA， Yoshimura F， et al. Molecular cloning and sequencing of the gene encoding the fimbrial subunit protein of bacteriodes gingivalis. J Bacteriol， 1988， 170(4):1658-65.
[55] Fujiwara T， Morishima S， Takahashi I， et al. Molecular cloning and sequencing of the fimbrilin gene of Porphyromonas gingivalis strains and characterization of recombinant proteins. Biochem Biophys Res Commun， 1993， 197(1):241-7.
[56] Sharma A， Sojar HT， Lee JY， et al. Expression of a Functional Porphyromonas gingivalis Fimbrillin Polypeptide in Escherichia coli: Purification， Physicochemical and Immunochemical Characterization， and Binding Characteristics. Infect Immun， 1993， 61(8): 3570-3.
[57] Washington OR， Deslauriers M， Stevens DP， et al. Generation and purification of recombinant fimbrillin from Porphyromonas (Bacteroides) gingivalis 381. Infect Immun， 1993， 61(3): 1040-7.
[58] Sharma A， Nagata H， Hamada N， et al. Expression of functional Porphyromonas gingivalis fimbrillin polypeptide domains on the surface of Streptococcus gordonii. Appl Environ Microbiol， 1996， 62(11):3933-8.
[59] Sharma A， Honma K， Evans RT， et al. Oral immunization with recombinant Streptococcus gordonii expressing porphyromonas gingivalis FimA domains. Infect Immun， 2001， 69(5):2928-34.
[60] Sharma A， Honma K， Sojar HT， et al. Expression of saliva-binding epitopes of the Porphyromonas gingivalis FimA protein on the surface of Streptococcus gordonii. Biochem Biophys Res Commun， 1999， 258(1):222-6.
[61]Kawabata S， Terao Y， Fujiwara T， et al. Targeted salivary gland immunization with plasmid DNA elicits specific salivary immunoglobulin A and G antibodies and serum immunoglobulin G antibodies in mice. Infect Immun， 1999， 67(11):5863-8.
[62] Shin EA， Lee JY， Kim TG， et al. Synthesis and assembly of an adjuvanted Porphyromonas gingivalis fimbrial antigen fusion protein in plants. Protein Expr Purif， 2005， 5.
[63]卢圣栋主编. 现代分子生物学实验技术. 第二版. 北京: 中国协和医科大学出版社， 1999.
[64]姜广水，郭红梅，等 牙龈卟啉单胞菌FimA蛋白和白细胞介素-15共表达质粒免疫小鼠的实验研究[J]华西口腔医学杂志，2007，25(2):177-179.
[65] 唐建国，茹炳根，徐长法，等. 蛋白质工程的研究. 北京大学学报(自然科学版)，1998，34(2):342～348.
[66] 崔立斌，马清钧. 新生肽的折叠与重组蛋白可溶性表达. 生物工程进展，1998 ，18(1) :36～40.
[67] 王惠珍. 蛋白质肽链的翻译后加工. 佛山科学技术学院学报，2000 ，18 (2) :70～75.
[68]杨运桂，童芹，郑卫东，等. 分子伴侣过量表达对蛋白质分泌及可溶性的影响. 中国生物化学与分子生物学报，2000 ，16 (3) :382～387.
[69] 俞峻，马康涛，张蘅. 分子伴侣的多重功能. 生物化学与生物物理进展，1998 ，25(1) :106～110.
[70] Park KY， Drory A， Woodson W R， et al.Molecular cloning of an 1-aminocyclopropan-1 carboxylic synthase from senescing carnation flower petals.Plant Mol Biol，1992 ，18(2):377～386.
[71] 黄培堂等译. 分子克隆实验指南. 第三版. 北京: 科学出版社，2002.
[72] Porath J，Carlsson J，Olsson I，et al. Metal chelate affinity chromatograPhy，a new approach to protein fractionation[J].Nature，1975，258(5536):598-599.
[73] Mathur D， Garg LC. Functional phosphoglucose isomerase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv:Rapid purification with high yield and purity[J]. Protein Expr Purif， 2007，52(2):373-378.
[74]Nilsson J， Stahl S， Lundeberg J， et al. Affinity fusion strategies for detection， purification， and immobilization of recombinant proteins[J]. Protein Expr Purif，1997，11(1):1-16.
[75] Chao H，Bautista D L，Litowski J，et al.Use of a heterodimeric Coiled-coil system for biosensor application and affinity purification[J].J Chromatogr B，1998，715(l):307-329.
[76] Flaschel E，Friehs K.Improvement of downstream processing of recombinant proteins bymeans of genetic engneering methods[J].Biotechnolo Adv，1993，11(1):31-77.
[77] Ford C F，Suominen I，Glatz C E.Fusion tails for the recovery and purification of recombinant proteins.Protein Expr Purif，1991，2(2-3):95-107.
[78] LaVallie E R，McCoy J M.Gene fusion expression systems in Escherichia coli[J].Curr Opin Biotechnol，1995，6(5):501-506.
[79]Terpe K.Overview of tag protein fusions:from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems[J].Appl Microbiol Biotechnol，2003，60(5):523-533.
[80] Hearn M T，Acosta D.Applications of novel affinity cassette methods:use of peptide fusion handles for the purificatinn of recombinant proteins[J].J Mol Recognit，2001，14(6):323-369.
[81] Uhlen M， Forsberg G，MoksT，et al.Fusion proteins in Biotechnology[J].Curr Opin Biotechnol，1992，3(4):363-369.
[82] Lamla T，Erdmann V A.The Nano-tag，a streptavidin-binding peptide for the purification and detection of recombinant proteins[J].Protein Expr Purif;2004，33 (1):39-47.24.
[83] Keefe A D，Wilson D S，Seelig B，et al.One-step purification of recombinant proteins using a nanomolar-affinity streptavidin-binding peptide，the SBP-tag[J].Protein Expr Purifi，2001，23(3):440-446.
[84] Vaillancourt P，Zheng C F，Hoang D Q，et al.Affinity Purification of recombinant Proteins fused to calmodulin or to calmodulin-binding peptides[J].Methods in Enzymology，2000，326:340-362.
[85] Einhauer A，Jungbauer A.The FLAG peptide，a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins[J].J Biochem Biophys Methods，2001，49(1-3):455-465.
[86] Nogueira-Dantas EO，Ferreira AJ，Astolfi-Ferreira CS，et al.Cloning and expression ofchicken anemia virus VP3 protein in Escherichia coli.Comparative immunology，Comp Immunol Microbiol Infect Dis，2007，30(3):133-142.
[87] Janknecht R，Martynoff G D，Lou J，et al.Rapid and efficient purification of native histidine-tagged protein expressed by recombinant vaccinia virus [J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1991， 88(20):8972- 8976.
[88] Butt T R，Jonnalagadda S，Monia B P，et al.Ubiquitin fusion augments the yield of clonedgene products in Escherichia coli[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86(8):2540-2544.
[89] Korf U，Kohl T，van der Zandt H，et al.Large-scale protein expression for proteome researeh[J].Proteomics，2005，5(14):3571-3580.
[90]Chopra A K，Brasier A R，Das M，et al.Improved synthesis of Salmonella typhimurium enterotoxin using gene fusion expression systems[J].Gene，1994，144(1):81-85.
[91] Chayen NE.Turning protein crystallisation from an art into a science[J]. Curr Opin Struct Biol，2004，14(5):577-583.
[92] Marco V D，Stier G.Blandin S，etal.The solubility and stability of recombinant proteins are increased by their fusion to NusA[J].Biochem Biophys Res Commun，2004，322(3):766-771.
[93] Kapust R B，waugh D S.Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptids to which it is fused[J].Protein Sci， 1999，(8):1668-1674.
[94] Janson J C，Ryden L.Protein purification:principles，high-resolution methods，and applications[M].2ed: 1997:311-342.
[95]Helfferich F.Ligand Exchange:a novel separation technique[J].Nature，1961，189:1001-1002.
[96] HochuliE，Dobeli H，Schacher A.New metal chelate adsorbent selective for proteins and peptides containing neighboring histidine residues[J].J Chromatogr，1987，411:177-184.
[97] Chiang Y W，Wu J C，Wang K C，et al.Efficient expression of histidine-tagged large hepatitis delta antigen in baculovirus-transduced baby hamster kidney cells.World J Gastroenterol，2006，12(10)，1551-1557.
[98] Vijayalakshmi M A.Pseudobiospecific ligand affinity chromatography[J].Trends Biotechnol， 1989，7(3):71-76.
[99] Sharma S，Agarwal G P.Interactions of proteins with immobilized metal ions:a comparative analysis using various isotherm models[J].Analyt Biochem，2001，288(2):126-140.
[100]Sharma S，Agarwal G P.Interactions of proteins with immobilized metal ions:Role of ionic strength and pH[J].J Colloid Interface Sci，2001，243(1):61-72.
[101] Chaga G S.Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatograPhy:Past，present and future[J].J Biochem Biophys Methods，2001，49(1-3):313-334.
[102]Ueda E K，Gout P W，Morganti L.Current and prospective applications of metal ion-protein binding[J].J Chromatogr，2003，988:1-23.
[103]Kim D H，Gareia A.A.Retention behavior of amino-acids using immobilized Ag(I)chromatography [J].Biotechnol Progress，1995，11(4):465-467.
[104] 邸泽梅，陈国亮，雷建都，等.金属螯合亲和色谱介质的合成及其色谱特性研究[J].色谱，1998，16 (4):297-300.
[105]McCormiCk D K.Expanded bed adsorption:the first new unit process operation indecades[J]. Biotechnology，1993，11:1059-1059.
[106] Batt B，Yabannavar V M，Singh V.Expanded bed adsorption process for protein recovery from whole mammalian cell culture broth[J].Bioseparation，1995，5:41-52.
[107]Porath J.IMAC-immobilized metal ion affinity based chromatography[J].Trends Analyt Chem，1988，7(7):254-259.
[108] Ueda E K ，Gout P W，Morganti L.Ni(Ⅱ)-based immobilized metal ion affinity chromatography of recombinant human prolactin from periplasmic Escherichia coli extracts[J].J Chromatogr A，2001，922(l-2):165-175.
[109] Dobrowolska G，Muszynska G，Porath J.Model Studies on iron(Ⅲ) ion affinity chromatography:interaction of immobilized metal with nucleotides[J].J Chromatogr A，1991，541:333-339.
[110] Govoroun M S，Huet J C，Pernollet J C，et al.Use of immobilized metal ion affinity chromatography and dye-ligand chromatography for the separation and purification of rainbow trout pituitary gonadotropins，GTH Ⅰand GTH Ⅱ[J].J Chromatogr B，1997，698(1-2):35-46.
[111] Casey J L，Keep P A，Chester K A，et al.Purification of bacterially expressed single
chain Fv antibodies for clinical applications using metal chelate chromatography
[J].J Immunol Methods，1995，179(1):105-116.
[112]Hutehinson M H，Chase H A.Adsorptive refolding of histidine-tagged glutathione S- transferase using metal affinity chromatography.J Chromatogr，A，2006，1128(1-2):125-132.
[113] Glynou K，Ioannou P C，Christopoulos TK. one-step purification and refolding of recombinant photoprotein aequorin by immobilized metal-ion affinity chromatography[J]. Protein Expr Purif，2003，27(2):384-390.
[114] Shi Y，Jiang C，Chen Q，et al.One-step on-colunm affinity refolding purification and functional analysis of recombinant human VDAC1[J].Biochem Biophys Res Commun，2003，303(2):475-482.
[115] Rehm B H，Qi Q，Beermann B B，et al.Matrix-assisted in vitro refolding of Pseudomonas aeruginosa class Ⅱ polyhydroxyalkanoate synthase from inclusion bodies produced in recombinant Escherichia coli[J]. Biochem J.2001，358:263-268.
[116] Lemereier G，Bakalara N，Santarelli X.On-column refolding of an insoluble histidine tag recombinant exopolyphosphatase from Trypanosoma brucei overexpressed in Escherichia coli.J Chromatog B，2003，786(1-2):305-309.
[117] 陈仁彪主编. 细胞与分子生物学基础. 上海：上海科学技术出版社，2000.
[118] Hasse-Pettingell C.A.and King J. Formation of aggregates from a thermolabile in vivo folding intermolabile in P22 tailspike maturation.A model for inclusion body formation.J.Biol.Chem 1988，263:4977-4983.
篇4
【关键词】 毛细管电泳 电化学发光 丙吡胺 血浆蛋白结合率 平衡透析
1 引言
毛细管电泳(capillary electrophoresis,ce)是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分析分离技术［1］，自诞生以来[1]，在蛋白质和多肽［2］、氨基酸[3]、药物[4，5]等分子的分离分析方面显示了强大的应用前景。它具有高效、快速、分析对象广、试剂消耗少、环境友好等优点。因为ce的进样量少，所以需要发展一种与之相匹配的高灵敏度的检测方法。而电化学发光(electrochemiluminescence,ecl)检测正响应了这一需求，它是化学发光和电化学过程的结合，由于其较低的背景信号而使得被分析物的检出限低、线性范围宽[6]。电化学发光体系中采用较多的是三联吡啶钌(ru(bpy)2＋3)反应体系，ru(bpy)2＋3在ecl反应中具有电化学可逆性和较好的稳定性。其ecl同ce联用已应用于药物分析以及药物与蛋白结合作用的研究中[7～10]。
丙吡胺(disopyramide,dp)是一种有效地预防和治疗抗心律失常的药物[11]。对药物蛋白的结合作用的研究有着重要的临床价值，因为游离药物的浓度会影响药物分布以及药物效应[12]。药物蛋白结合率是药物动力学的重要参数之一， 研究药物和蛋白作用的方法主要包括平衡透析、超滤、核磁共振光谱、质谱、色谱、毛细管电泳等方法[13]，其中测定药物游离浓度最常使用的方法是平衡透析[14]。本实验采用传统的平衡透析方法，利用ceecl技术测定了dp对人血浆蛋白的结合率。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
mpia型毛细管电泳电化学发光检测仪(西安瑞迈分析仪器有限公司，中科院长春应用化学研究所)，该仪器由数控毛细管电泳高压电源、多功能化学发光分析仪、电化学分析仪三部分组成，并与计算机联用。本实验使用了50 cm长、内径为25 μm的未涂层的熔融石英毛细管(河北永年光纤厂)。ceecl检测池已有报道[15]。柱端ecl检测池中采用了传统的三电极体系：ф500 μm pt圆盘电极作为工作电极、pt丝为对电极、ag/agcl (饱和kcl)为参比电极。工作电极和毛细管出口端在显微镜下(×40)调整为准直，其距离为125 μm。
ru(bpy)2＋3 (aldrich, 美国milwaukee公司)，丙吡胺（dp，美国sigma公司)。其它试剂均为分析纯。透析袋(8000 da)(上海amersham公司)。实验用水经milliq 系统(美国millipore公司)纯化。用于毛细管电泳所有溶液均放置于4 ℃冰箱，并且进样前先用0.22 μm滤膜(上海新亚净化材料厂)进行过滤。
2.2 实验方法
新毛细管充入1 mol/l naoh浸泡12 h。活化后，毛细管使用前先用0.1 mol/l naoh冲洗10 min，然后用水冲洗10 min，最后用电泳运行缓冲液冲洗10 min。每次实验前，在ecl检测池中加入约600 μl 5 mmol/l ru(bpy)2＋3(配制在50 mmol/l pbs(ph 7.5）中)。ecl信号由mpia系统记录。光电倍增管高压设置为－850 v，恒电位为1.3 v，进样电压为10 kv，进样时间10 s，运行电压为15 kv。运行缓冲液为30 mmol/l pbs(ph 7.5)。
2.3 丙吡胺与血浆的反应
2.3.1 平衡时间的测定 取100 μl 0.01 mol/l dp与90 μl血浆混合，在37 ℃下孵育透析，透析袋外为4 ml 30 mmol/l pbs(ph 7.5)。每隔0.5 h，取100 μl透析袋外的溶液，测定其ecl强度，直到ecl强度达到稳定。
2.3.2 给药量与结合药物量的关系测定 取一系列体积0.05 mol/l dp与90 μl的血浆混合，37 ℃时孵育透析，透析袋外为4 ml pbs 30 mmol/l（ph 7.5)。达到平衡后，分别取透析袋外溶液100 μl测定其ecl强度。
3 结果与讨论
3.1 检测池ph值的优化
对于ceecl检测，许多检测条件如缓冲溶液、检测电位，进样量等都对待测物ecl强度存在影响。其中，检测池ph对ecl信号的强度影响很大，因为ru(bpy)2＋3与共反应物之间的反应依赖于ph，最大ecl峰强通常在稍显碱性的条件下取得[16]。实验考察了柱端检测池中缓冲溶液的ph对ecl强度的影响。dp的浓度为300 μmol/l，运行缓冲溶液为30 mmol/l pbs (ph 7.5)。检测池中为5 mmol/l ru(bpy)2＋3 (配制在50 mmol/l pbs中)，选择ph值从5.2～9.0之间对ph进行优化(见图1)，当ph 5.2～7.0时，ecl信号一直在增加。ph 7.0～7.5时，ecl强度几乎是一个平台。ph＞7.5后，ecl峰强逐渐下降。本实验选择检测池的ph为7.5。
图1 ph 对ecl强度的影响（略）
fig.1 effect of ph on electrochemiluminescence (ecl) intensity
300 μmol/l disapyramide(dp); 电动进样(electrokinetic injection): 10 kv×10 s；分离电压（separation voltage）: 15 kv; 检测电位(detection potential): 1.3 v；运行缓冲液(running buffer): 30 mmol/l pbs, ph 7.5; 检测溶液(detection solution): 5 mmol/l ru(bpy)2＋3溶于50 mmol/l pbs(5 mmol/l ru(bpy)2＋3 in 50 mmol/l pbs)。
由于ru(bpy)2＋3 的氧化电位在1.15 v左右，实验中采用了略高于其氧化电位的1.3 v作为检测电位；实验中发现，ecl强度随ru(bpy)2＋3浓度增加而不断增大，ru(bpy)2＋3浓度达到5 mmol/l并继续增大时，ecl强度趋于饱和，故实验中采用5 mmol/l ru(bpy)2＋3。
3.2 丙吡胺的电泳图
丙吡胺的电泳图如图2所示。以30 mmol/l pbs (ph 7.5)稀释得到了100、300、500、700和1000 μmol/l dp标准溶液。检测池中为5 mmol/l ru(bpy)2+5溶于50 mmol/l pbs (ph 7.5)中，运行缓冲溶液为30 mmol/l pbs (ph 7.5)。dp的出峰时间约6 min，可以看出，随着dp浓度的升高，其峰强逐渐增大。
图2 丙吡胺的电泳图（略）
fig.2 electropherograms of dp
dp (μmol/l): 1. 100； 2. 300； 3. 500； 4. 700； 5. 1000; 其它条件同图1（other conditions were same as fig.1）。
3.3 丙吡胺的线性范围、检出限及重现性
在恒电位1.3 v；进样电压10 kv持续10 s；分离电压15 kv；运行缓冲液30 mmol/l pbs（ph 7.5）；检测池中为5 mmol/l ru(bpy)2＋3 稀释于50 mmol/l pbs中（ph 7.5)，以30 mmol/l pbs（ph 7.5）稀释得到100 μmol/l dp溶液，进样6次测定其峰高与时间的rsd分别为4.94%、0.24%。用30 mmol/l pbs(ph 7.5)配制了一系列标准溶液测定dp的线性范围，得到其线性范围10～1000 μmol/l，线性回归方程为y=78.87+2.34×103x, 其中y为ecl强度，x为dp的浓度；r为0.9947。检出限为10 μmol/l(s/n=3)。
3.4 丙吡胺与血浆蛋白的反应平衡时间的测定
本实验采取平衡透析的方法来研究dp与血浆蛋白间的作用，采用正常人体温37 ℃为反应温度，其达到平衡所需要的时间通过ceecl表征得到。取100 μl 0.01 mol/l dp与90 μl 血浆混合，在37 ℃下孵育透析，透析袋外为4 ml 30 mmol/l pbs (ph 7.5)。每隔0.5或1.0 h，取透析袋外溶液100 μl测定其ecl强度。为了减少仪器带来的误差，每次测透析袋外溶液时先测定250 μmol/l dp溶液(总的ecl强度)，得到的相对ecl强度可以通过为透析袋外dp的ecl强度与总的ecl强度的比值。
如图3所示，随着反应时间的增加，相对ecl强度逐渐增大，大约4 h后，达到一个平台(60%)，表明反应达到平衡。
图3 相对ecl强度随时间的变化（略）
fig.3 relationship between relative ecl intensity and time
孵育温度（incubation temperature）, 37 ℃; 透析袋外溶液(solution inside dialysis bag): 100 μl 0.01 mol/l dp及90 μl血浆蛋白(plasma protein); 透析袋外溶液(solution outside dialysis bag): 4 ml 30 mmol/l pbs (ph 7.5); 其它条件同图1(other conditions were the same as fig.1）。
3.5 丙吡胺结合浓度与血浆中总药浓度之间的关系
取一系列体积的0.05 mol/l dp溶液与90 μl血浆混合，将这一系列透析袋在37 ℃下孵育透析，透析袋外为4 ml 30 mmol/l pbs (ph 7.5)。大约4 h反应平衡后，分别取透析袋外溶液100 μl测定其游离的ecl强度。
在平衡透析的过程中，血浆蛋白以及结合型的药物都不能透过透析袋，只有游离的药物dp才能透过透析袋，所以在达到透析平衡后，透析袋内游离型的药物浓度等于透析袋外游离型药物的浓度。袋内蛋白结合型的dp浓度为药物总量减去游离药物 (即透析袋内游离药物量与透析袋外药物量之和) 的差值除以透析袋内溶液的体积。
药物的血浆蛋白结合率是指血浆中与血浆蛋白结合的结合型药物占血浆中该药物总含量的百分比。
在透析袋中加入不同体积的0.05 mol/l dp和90 μl血浆蛋白,此透析袋浸入4 ml 30 mmol/l pbs (ph 7.5)中，在37 ℃下反应4 h; 取袋外溶液进行ecl测定。
人血浆中dp的浓度为1.6 ～ 8.2 mmol/l时，dp与血浆蛋白的结合是呈线性的，线性回方程为y=0.93x－0.07，其中x为袋内dp的总浓度，y为袋内蛋白结合型dp的浓度。相关系数r为0.9999。dp与血浆蛋白的结合率测定结果见表1，5次测定的平均值为90.4%，即dp与人血浆蛋白的结合率为90.4%。
表1 丙吡胺与人血浆蛋白结合率测定结果（略）
table 1 protein binding rate of disopyramide with human plasma protein
【参考文献】
1 jorgenson j w, lukacs k d. anal. chem., 1981, 53(8): 1298～1302
2 xiang xiaolan(项小兰), wu guiyong(吴桂勇), he jinlan(何金兰). chinese j. anal. chem.(分析化学), 2008, 36(3): 353～356
3 sunada w m, blanch h w. electrophoresis, 1997, 18 (12／13): 2243～2254
4 sadecka j, polonsky j, shintani h. pharmazie, 1994, 49(9): 631～641
5 jing ruijun(荆瑞俊), jiang xiaoying(姜小莹), hou shurong(侯书荣), li xiangjun(李向军), yuan zhuobin(袁倬斌). chinese j. anal. chem.(分析化学), 2007, 35(8): 1187～1190
6 fahnrich k a, pravda m, guilbault g g. talanta, 2001, 54(4): 531～559
7 zhao x, you t, liu j, sun x, yan j, yang x, wang e. electrophoresis, 2004, 25(20): 3422～3426
8 fang l, yin xb, sun x, wang e. anal. chim. acta, 2005, 537(1／2): 25～30
9 liu j, yang x, wang e. electrophoresis, 2003, 24(18): 3131～3138
10 huang y, pan w, guo m, yao s. j. chromatogr. a, 2007, 1154(1/2): 373～378
11 mayer f, kamer b k, ress k m, k uhlkamp v, liebich h m, risler t, seipel l. j. chromatogr. b, 1991, 572(1／2): 339～345
12 kwong t c. clin. chim. acta, 1985, 151(3): 193～216
13 zhou dawei(周大炜), li ledao(李乐道), li famei(李发美). chinese journal of chromatography(色谱), 2004, 22(2): 116～120
篇5
我伤心地趴在地上，嚎啕大哭。周围的人们却用奇怪的眼神看着我，然后鄙视地说：“这么小就发春了……”我听不懂意思，然后无奈地磨爪子，摸摸自己可爱的小绒毛和小肉垫，然后发誓今天晚上我很伤心，决心只吃一条鱼。我听见过其他野猫叫的声音，还问过一只老猫，她喵呜喵呜地告诉我，野猫半夜猫叫一般都在发春，我眨眨眼睛问她什么是发春。她摇摇头深沉地告诉我，小孩子懂这么多要干么。然后很善良地还教我发出喵呜喵呜拉长的声音，她说这个猫叫声听起来比较妩媚，以后我择偶的时候，提供给我选择的公猫会比较多。我感激地让她摸了摸我的粉红小肉垫。
晚上我真的只吃了一条鱼。从垃圾桶捡来的，味道很恶心。可是那只老猫告诉我，猫都喜欢鱼的。我是猫，当然喜欢鱼，于是我咽了下去。我做了个梦，梦到有一只善良的母猫还有一只猥琐的不明生物。不明生物对母猫不知说了什么，母猫惊叫不要。她满脸是泪，我见尤怜。我同情心泛滥，却不知道怎么安慰母猫。
然后一觉醒来我发现我换了新地方。不是那个舒服的纸皮堆，而是干干净净的毛毯。我一滚，毛毯就变色了。变得黑黑的脏脏的，上面还有我的爪子印。我默哀着毛毯，一边打量自己所在的地方。是屋子，有家具，有吃的。打量完毕。
另一间屋子的门突然开了，嘎吱的声音让我觉得很悦耳。然后我抬头以45°明媚而忧伤的姿势仰望。是一个人类。有头发有眼睛，还有嘴巴鼻子和耳朵。然后是雄性。
雄性人类似乎惊讶于我的苏醒，然后不管不顾地扑上来呼唤我羞羞……我震惊而愤怒，我做为一个雌性猫咪，绝对不能让一个雄性人类破坏了我的和清白！我爪子抓过去，然后愤怒地要撕咬。结果雄性人类却猥琐地摸了摸我引以为傲的粉色小肉垫傻乎乎地笑了。
这件事情过去一年多了，我也不再是年幼无知的小野猫了。我成了这位雄性人类口中的宠物，名字叫做羞羞。据说我是他口中从天而降的莫名其妙的宝贝。他让我唤他主人，我扭捏地给他一爪子。因为他不仅是个猥琐的变态，还好面子，勒令我不准在他房间撒尿。
现在我是一只小家猫，我有名字，我叫羞羞。
二
老大！怎么办啊！袅袅跟着那个人类住在一起了！一只哭泣的水獭以明媚而忧伤45°仰望高高在上，实际比自己矮的一只狐狸。
，我们不会去抢回来啊！王上只规定我们把袅袅带回来，其他的什么都没规定，怕什么。天塌下来，有例如我这样高的狐狸顶着。
水獭的内心泪水在汹涌。明明我一直比你高的……
二人组制订了完美的计划。名字很好很动听，叫做袅袅的浪子回归路。
请原谅这两只动物的用词不当，毕竟这是这两只动物商量一晚上否决一晚上得出的理论。
第一步。袅袅出现了，好白好亮的皮毛啊！狐狸羡慕地望向那只白色的猫，然后变身狐狸犬的他被旁边伪装成老鼠的树獭揪着办正事。老大老大，那个雄性人类要上班了，袅袅现在一个人在家，我们去抢吧！
狐狸淡定了，高傲地对书獭说。你进攻，我帮你四处看着。树獭内心更有泪水奔腾。不带这么欺负树獭的啊。树獭不情不愿地颤抖着走到猫的面前。你好……嗨……
白猫无视了这只奇怪的老鼠，思索着今天好像没有摸自己的小肉垫。
树獭的胆子大了起来，然后慢慢捂住白猫的眼睛，大叫着。狐狸老大快来帮忙啊！
白猫一爪推开这只找死的老鼠，继续思索这个伟大的问题。
引诱袅袅的回归路。宣告毁灭。
第二步。很好，袅袅又出现了。
树獭举着一条自己很舍不得的鱼隆重做了告别仪式，狐狸又气又急，然后在一旁安慰自己他笨他脑子有问题……树獭举着这条鱼，从阳台上悄悄进入白猫所在的屋子。安稳入睡的白猫翻了个身，继续睡。树獭坚持不懈地把鱼高举于白猫的眼前。
白猫翻了个身，还是睡。其实无论怎么翻，她仍然是趴着的。
内心激浪的树獭仰天泪流。狐狸老大，袅袅的浪子回归路，任重道远啊……
第三步。决心自己出手的狐狸相信自己一定能使袅袅重新回到他们身边的。他趁着袅袅在大街上闲逛的时候，拦住了她。然后飞扑着流泪……袅袅，我是狐狸叔叔啊……
白猫羞羞觉得自己今天遇到了两只神经病。狐狸哭诉着自己这几年过得不好，王上虐待，没有袅袅在身边寂寞难耐……羞羞无语地望天。 狐狸终于说出了一句正常严肃的话。羞羞，跟我走，大家都找?煤镁昧恕
茫然的羞羞抖了抖耳朵。狐狸严肃地对着茫然的白猫教育道。你是王上的三姑妈的六阿姨的四妹妹生的女儿，由于王上的三姑妈的六阿姨的四妹妹生你时跑出了生命森林，最后把你生在了人类世界，却和你失散了……袅袅，你妈妈很想你。
白猫羞羞石化了。没想到自己还有个妈妈？！而且自己根本不是人类世界的普通猫？！太惊悚了，比和雄性人类看所谓鬼片还惊悚！ 无法接受现实的白猫羞羞可耻地晕过去了……
三
白猫羞羞知道这次醒来一定在不同的地方。
是洞穴。
一只善良的白猫泪奔着朝自己飞扑而来。不用说，这是梦中的善良白猫，也是狐狸口中的妈妈了。被妈妈紧抱着的羞羞感到一种从未有过的幸福。很满足，比吃了雄性人类给自己的猫饲料还满足。
洞穴外渐渐有个黑点朝着自己走来。羞羞抬起头，却看到一匹纯白的似马非马的物种。善良白猫热情地介绍物种。这是马猫，是王上，至于辈分……怎么也想不出怎么让袅袅称呼马猫的猫妈纠结着。
羞羞看着马猫，眨巴着猫眼善良地问了一句。难道你真是马和猫生出来的？羞涩的马猫不好意思地承认了。
被雷得风中凌乱的羞羞仰天无语。
生命森林的动物很奇特。生命森林的动物很人类化。生命森林的动物很好相处。
善良的猫妈，猥琐的狐狸和树獭，以及奇怪物种马猫。从这一天起，羞羞正式改名为袅袅。
袅袅却时常很忧伤，她想起雄性人类的家，想起那群人类世界的野猫，想起雄性人类的温柔，想起他的忍让。袅袅叹了口气。难道自己还不知足么？
善解人意的猫妈让袅袅最后一次回去人类世界。袅袅回到了她和雄性人类住的屋子。很干净，地上还残留着她的猫毛。可是这个时候，雄性人类不是下班了么？她看到桌上有一叠纸，写着鸟语，不懂。却看到有照片，照片上骄傲的白猫不屑地望着镜头。
袅袅的眼角有透明液体。她自我安慰：猫是不轻易流泪的。
雄性人类回到了家，他看到袅袅激动地扑上出，泪如泉涌。羞羞，羞羞……我以为你走了……再也不回来了……
不喜欢矫情的羞羞一爪子拍开他，眼角却有透明的液体。
袅袅回到了这件屋子。回到了人类世界。
她还是羞羞，不是袅袅。
生命森林的动物们制定了很多的袅袅的浪子回归路计划。连猫妈都出动了。
羞羞不为所动依然淡定地在人类世界当一条普通的白猫。
篇6
闲话休提，下面我就来说几个不同寻常的图画书爱情故事吧。
《活了100 万次的猫》
有一只漂亮的虎斑猫，活了100万次，死了100 万次，有100 万个主人曾为他伤心流泪，可他完全无动于衷，直到他终于成为了只属于他自己、且最爱他自己的猫――野猫。可是有一天，他遇见了一只白猫……他呆在了白猫的身边，然后有了一群小野猫。最后，当白猫死去时，他抱着白猫哭了100 万次，然后躺在她的身边，再也没有活过来。原来100 万次无聊的生命，也抵挡不住一次真正的爱情！
《我是谁？我的爱》
“ 我” 是一只古怪的动物，“我”不知道自己是谁，也没人说得清“我”是谁。“我”苦苦地寻觅着答案，但总是迷惘在路途中……可是另一只古怪的动物出现了，“我”不知道它是谁，可是它却说“我喜欢你的毛”。“我”问它，你知道我是谁吗？它却很肯定地说：“你是我的爱！”这也许是最荒谬的答案，可是，还有比这更好的答案吗？
《爱的奇妙滋味》
青蛙弗洛格这几天感觉很不自在，一会儿冷、一会儿热，而且心怦怦直跳。博学的兔子告诉他：他恋爱了。青蛙爱上的是鸭子，可是小猪认为绿色的青蛙和白色的鸭子怎么可能般配？为了证明自己的爱情，青蛙苦练蛙跳，想要打破世界跳高纪录，可不小心摔伤了。这时，是谁来到了青蛙的身边？谁又来照料青蛙的伤痛？当然是鸭子！爱，是最特别的滋味，又是最无法拒绝的礼物。
《小猪的爱情》
一大早，小猪满脸洋溢着爱的喜悦，他手拿着鲜花上路了。一路上，他遇见了优雅的长颈鹿女士、健壮的大象姑娘、美丽的鱼小姐、会不停跳舞的蜜蜂姑娘，还有凶猛的鳄鱼小姐。每次，他鼓足勇气说：“你能做我的女朋友吗？”结果不难猜到。正当他要打退堂鼓之际，一只披着狼皮的猪小姐出现了……还是一个经典童话式的结局，可是充满了顽皮和惊奇。
篇7
对于日化行业来讲，能源以及原材料的涨价是其最主要的压力来源。因为石油既是燃料，又是必不可少的重要原材料。在国际油价上涨，而我国石油对外依存度接近50％的情况下，日化行业面临的压力可见一斑。据中国海关7月10日的数据显示，今年上半年，我国进口原油达2101万吨，进口量较去年上升了16.4％，进口金额则较同期上涨106.4％。据统计，国内8家日化上市公司自2006年以来销售毛利率持续下降，前年、去年和今年一季度的平均销售毛利率分别为24.61％、24.03％、21.58％。
“今年是中国日化行业非常艰苦的一年，不但受上游成本、运输费用大幅上升的影响，同时此前雪灾、地震等特大灾接连发生，令市场销售受到非常大的制约。”业内人士表示，日化行业竞争白热化，企业怕丢市场不敢轻言提价，但是油价这样疯狂飙升，再不提价大家都扛不下去了。
“只用一年时间，国际原油价格从70美元每桶狂涨到140美元的水平，以石油衍生物为原料的日化行业利润日益压缩是不争的事实。例如洗涤用品，成本的上涨已经超过100％。”立白新闻发言人许晓东表示，由于洗衣皂受石油价格影响巨大，去年公司已经作出调价。“保证合理的利润是企业保证产品质量的一个重要因素。”
涨价策略：圈出消费者价格敏感产品
对不同品类的产品，宝洁采取了多样化的提价策略。在宝洁产品体系中，原本利润空间有限的洗衣粉、洗衣皂产品最先受到原材料涨价的冲击，宝洁的提价也从这里开始。“今年宝洁洗衣粉价格已经调过几次了，但是都采取减量不减价的方式，如520克包装降为508克，1.8千克包装降为1.7千克。因为消费者对这类产品的价格太敏感了，宝洁要用影响最小的方式来实现涨价。”宝洁经销商如是说，其实分销商对减量是很清楚的，但消费者就不这么在意了。
而宝洁产品有计划地全线涨价从6月份开始。在这次提价产品选择上，宝洁考虑最多的是消费者的价格敏感产品。“在洗发水品牌中，宝洁为什么最先拿潘婷试水呢?因为潘婷的定位是营养，头发健康亮泽，比较高端，这部分消费者对价格不是很敏感。而对于飘柔、海飞丝这两个面向大众消费者的品牌，宝洁对涨价就相当谨慎，近两个月内都可能不提价。”
此外，即使同一品牌的产品也有不同的敏感度。在这次玉兰油沐浴露涨价过程中，不同档次、不同规格产品的涨价幅度是不一样的。如一个地级市，200毫升包装的玉兰油沐浴露是消费者的价格敏感产品，所以在这次调价过程中，厂家给分销商在这类产品上有一个上下浮动空间。而对于价格敏感度低的玉兰油护肤品等，宝洁可能就通过包装的升级来提价。
竞争对手：或悄然跟风或静观其变
宝洁涨价，劲敌联合利华紧随其后，也调高了旗下部分产品的售价。但是两大日化巨头对于提价产品的选择颇为相似――瞄准价格神经相对迟缓的高端产品，联合利华消化成本压力对象亦为旗下高端产品。以新近涨价的产品来看，力士洗发水、香皂，奥妙洗衣粉以及中华牙膏均为同类产品中的贵价商品，其涨幅分别为6％、10％～12％以及20％左右。而旗下清扬去屑洗发水非但未提价，还以广告战、价格战等形式，与劲敌宝洁旗下同类产品海飞丝争夺中低端护发产品的市场份额。
在把纽崔莱等营养品全线提价5％后，安利也计划把旗下的个人护理用品，如洗发水、沐浴露等进行提价。另外，上海和黄白猫市场总监虞忠勤表示，白猫产品也将直接提价，不采取缩减容量或是其他“变相提价”的方式。但是，产品的提价幅度小于石油的涨价幅度，控制在10％，至于劳动力等成本的因素公司都已经内部消化了。据悉，上海家化届时也会有相应涨价动作。
“无论是否涨价，恒安都将在纸类产品的市场份额、销售收益、行业整合上获益。”业内分析人士这样认为。今年3月，恒安已将其纸巾产品批发价调高8％，恒安首席财务官卢康成对外表示，未来纸市价会否再次调高主要看行内其他的对手。但在宝洁频繁涨价之时，恒安却按兵不动。而且在3月份涨价后至7月末，恒安的产品销售一直处于稳定增长趋势，尚看不出宝洁的涨价行为对其有何影响。
广州好迪公司总经理黄家武在接受媒体采访的时候表示，国际油价上涨对企业成本造成一定的压力，但目前不是好迪提价的时机。据黄家武称，目前200ML好迪洗发水零售价格在10～11元之间。这对比提价前宝洁飘柔系列200ML定位16元左右的价格，有一定的优势。“虽然日化产品原料差不多，但是每个企业对石油价格上涨的承受能力会有不同。而且从油价的供求情况看，油价一直高位的可能性不大，这个时候提价，我们认为并不是长远打算。”拉芳国际集团新闻发言人崔洪喜也否认旗下拉芳和雨洁会跟随宝洁提价。
日化行业：低端市场或许面临洗牌
篇8
话剧开始了，出现了独眼狼、单眼狼，他们被关进大牢里，外面有很多士兵守卫。就在这个时候，臭狐狸代表大灰狼来看他们。它手里拿着一盒曲奇饼干，说：“我特意代表大灰狼来看你们了，这盒饼干是我们的一点心意。当年大灰狼和你们一起坐牢，可是被一场海啸分开了，这次我们找到了你们，特意送来饼干，表示一点心意……”
狐狸走了，卫兵也走了。独眼狼和单眼狼食偷偷地把曲奇饼干盒打开，他们发现盒子里面有一个纸条和一把万能钥匙，他们说：“这一定是大狼给我们的。”然后他们说，这两天一定会来一场大大的雷阵雨，所以要它们趁雷阵雨和雾气很大时把门偷偷打开，逃出去。
当然，这个计划成功了。半路上，突然听到黑猫警长的声音，他们拼命的逃，逃到了一家超市店门口，因为今天有雷雨，超市提前关门。他们突然想起自己手中有一把万能钥匙，他们就用万能钥匙把门打开，进入超市偷走了很多东西，把肚子也填饱饱的了。
可当出来的时候，发现黑猫警长把他们包围了。这时，大狼和狐狸从四周杀来救他们，于时他们冲出了包围。坏蛋们一起逃啊逃啊，突然发现黑猫警长在前面拦住了他们，白猫警长和小鹿警官在后面拦住了他们，使他们无路可逃，又被关进了大牢。
篇9
一个人的音乐使命
在我们的传统认知中，狼作为捕猎者、强者，似乎总会和“恶”相关联，但当它们被迫站在人类对立面，却变成了不折不扣的弱者。
1992年，加拿大育空地方政府因为当地驯鹿数量日益稀少，决定通过捕杀狼群来实现“驯鹿增量计划”。明明是人类肆意破坏自然环境造成的恶果，却让无辜的狼来承担罪名，付出生命，音乐人马修・连恩愤怒了，他率领30多位音乐工作者耗时两年完成《狼》这张专辑，为狼申辩，向民众宣扬“建立栖息地（保护区）”才是保护驯鹿的正确方式。
从《狼》《驯鹿宣言》到《美丽新世界》《倾听大地的声音》，20多年的不懈努力，让马修・连恩成为了享誉全球的环保音乐家，他实现了年轻时的宏愿――“尽力用音乐唤醒性命之爱”。
一只猫的妙想天开
试想一下，当我们发现一个新的世界，在那里，主角并非人类而是各种奇异生物，那会是怎样的体验？
这个答案可以从《塞拉菲尼抄本》中去寻找。
这是一部幻想世界的百科全书，书里的文字体系都是全新的，所以当你翻开这本书时，不用为自己看不懂而羞愧，面对这部妙想天开的书，所有人都是“文盲”。我们可以像尚未识字的孩子，只需跟着图片去想象那个奇妙世界。
更有趣的是，陪伴塞拉菲尼完成这部幻想世界百科全书的，是一只白猫，塞拉菲尼说：“那只白猫才是抄本的真正作者，而不是我。虽然我一直以作者自居，但其实不过是一个平凡的抄写员而已。”
这可爱的“坦言”是不是已经让你浮想联翩了？不必犹豫，那个关于猫的妙想世界已经在召唤你了。
一头熊的寓言故事
看到《熊的故事》这样一个名字，你大概会以为这是部普通的纪录片吧。起初小编也这么以为，然而电影一开始，就把人带到了一个迷人的世界：花草繁茂的山坡，大熊笨拙地掏着蜂蜜，小熊在一边自在玩耍……在没有任何解说的情境中，我们被缓缓带入了熊的视角。直到猎人的介入，打破了熊与外界的平衡。
在电影中，当猎人费尽心机要捕杀当初那只从他们枪下挣脱的大熊时，却不小心陷入了赤手空拳面对大熊的险境，在最后时刻大熊却选择离开，不伤害人，而猎人似乎也被感化，没再捕杀大熊。这种相互宽恕是全片最令人动容的时刻，“退一步海阔天空”得到了最好的验证。
别忘了，我们不过是世上万千物种之一，没有谁是这个地球的真正主角。作为有灵性的人类，如何跟同居一个地球的动物和谐相处，找到一个平衡点，是永恒的话题。
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看惯了好莱坞动画宣扬的“我们与众不同，这就是生命奇特的地方”，《了不起的狐狸爸爸》会告诉你，我们人类与别的地球公民并没有不同。
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篇10
洗涤品、化妆品及药品市场信息基于CMMS2001年度全国30城市的7万消费者的入户调查结果。以下试图通过图表式分析，为读者提供一些洗涤品、化妆品及药品消费者市场信息数据。
图1是全国30个调查城市洗涤品、化妆品及药品的品类渗透率示意图。在洗涤用品方面，洗衣粉品类的渗透率高达99.4%，碗碟洗洁精为92.0%。在化妆品类中，润肤/护肤品为60.4%；沐浴露的品类渗透率达到了48.2％，反映出30个城市近半的居民在本年度使用过沐浴露，从洗浴角度而言作为香皂的替代品，沐浴露已经得到普遍使用。
在化妆、美容性的产品中，洁肤品虽然在本类别中品类渗透率为34.1％，但是考虑洁肤品作为很平常的个人护理用品，从普遍意义上说，中国城市居民洁肤品的使用量还远远不够，也意味着这种产品还有很大的发展空间。
在药品中，感冒药是“一枝独秀”，止咳药/润喉药的渗透率则紧随其后，其他的药品渗透率差距并不太大。从图1中能很清楚的看出各种产品在30城市的渗透率对比，反映了这些产品在过去一年中的整体市场渗透情况。
图2.1反映的是北京、上海、广州三地常用药品的品类城市发展指数对比状况，从图2.1中可以看出，除了感冒药之外，其他5类药品即肠胃药、止咳药/润喉药、止痛药、皮肤药、眼药的品类城市发展指数，为广州与北京和上海相比拉开很远，城市间差异非常明显。表明广州使用这5类药品的居民比例远高于京沪两地。上海和北京两城市间对比，除了皮肤药之外，其他5类药品的品类城市发展指数差距不大。
图2.2反映的是北京、上海、广州三地功能性药品，即综合类营养补品、减肥类营养品的品类城市发展指数对比状况，在上海，这两种品类的发展指数十分接近，而在北京和广州，这两种品类的指数都有较大的差别。在北京，减肥类营养品指数高于广州的综合类营养补品指数，在广州恰好是相反。就减肥类营养品而言，北京的品类城市发展指数要比广州高得多。因此可以认为由于南北饮食结构、气候的差异影响着居民对于营养品的使用产生了不同的。
图2.3反映的是北京、上海、广州三地家庭日化用品洗衣粉、碗碟洗洁精、杀虫剂的品类城市发展指数对比状况，从图2.3中可看出，三地洗衣粉的发展指数基本相当，杀虫剂的发展指数上海、广州远高于北京，这似乎反映出湿热多雨的城市比较干燥的城市使用杀虫剂的情况更为普遍。
图2.4反映的是北京、上海、广州三地头发定型、沐浴露、润肤/护肤品、洁肤品产品的品类城市发展指数对比状况，从润肤/护肤品来看，北京由于天气较为干燥，风尘相对南方较大，润肤/护肤品可能更普遍地被使用。至于沐浴露的情况，广州的品类城市发展指数比京沪明显高出一大截。而且发展指数高达近180，说明该类产品在广州的发展现状比在京沪两地的更具优势。另外，三地的洁肤品的发展指数则显示出大体相同的水平。
图3为全国30城市洗衣粉类2个主要品牌奥妙和雕牌的消费者忠诚度与全国平均水平的比较结果。如图所示，从哈尔滨到青岛的北方地区及海口、南宁、长沙、南昌及合肥的奥妙消费者忠诚度普遍较低，而在江浙、上海地区则忠诚度普遍较高，奥妙在福建、广东的福州、厦门、广州、深圳、佛山以及郑州、西安、成都、重庆、昆明等城市的忠诚度距全国平均水平相差不很大。而雕牌在各地区没有明显的地区差别，仅在福州、南昌及长沙具有较高的忠诚度。总体而言，奥妙和雕牌的忠诚度存在着明显的地域或城市差别特征。
图4表示的是洗发水飘柔、沐浴露六神、头发定型品雅倩3类第一品牌的全国30城市渗透率状况。如图所示，飘柔品牌在全国30城市渗透率相对变化幅度并不很大，反映出很强的超越地理能力，而沐浴露六神、头发定型产品雅倩相对城市同比渗透率变化较大，特别是沐浴露六神品牌仅在厦门为最高，而在佛山则最低，品牌超越地理能力表现得相对最弱。
图5表现的是相同类不同产品品牌渗透率在全国30城市的表现状况。以外资品牌吗丁啉和国内品牌三九胃泰为例。从图中可以看到，吗丁啉除在本部所在地西安有较高的渗透率（16.6%）外，在华北、华东的北京、天津、太原、青岛、南京、上海、苏州、宁波均有较高的渗透率，而三九胃泰相对吗叮啉比较而言，仅在东北的哈尔滨、长春、沈阳、大连有略高的渗透水平。三九胃泰的品牌渗透率在全国范围则无明显的区域优势，在全国30城市渗透率高低分布平衡，从总体上看，吗丁啉全国平均渗透水平为9.6%，三九胃泰6.5%，三九胃泰作为本土肠胃药生产企业的代表与吗丁啉在品牌渗透率上尚有一定的差距，但是，这种渗透率的差距也反映出了国内药品生产企业在市场竞争上同跨国外资企业的差距正在接近。
表1为全国30城市洗涤、化妆品及药品品类渗透率、第一品牌的渗透率及第一品牌最经常消费比例数据。从表中第一品牌渗透率可以看到洗发水类飘柔为52.2%、卫生巾的护舒宝为48.3%。在药品大类中，感冒药品类中感冒通为31.2%，润喉药中的金嗓子喉宝为22.1%。
就整体而言，各品类的第一品牌渗透率相差很大。从最经常消费的第一品牌的比例来看，药品类中的芬必得为33.2%，达克宁为29.3%。在卫生用品、化妆品中，护舒宝、大宝、飘柔分别为26.6％，27.9%和23.7%。化妆品、卫生用品与药品比较，药品的第一品牌的最经常消费比例相对较高。
值得注意的是，在表1中，多数第一品牌渗透率与最经常消费比例的第一品牌是相同的，只有洁肤品中，渗透率第一品牌为小护士，而最经常消费比例的第一品牌为大宝，反映出多数品牌效应还是比较稳定的。
表2为全国30城市碗碟洗洁精第一品牌渗透率的数据。洗衣粉类全国第一品牌渗透率最高的是奥妙为49.5%，碗碟洗洁精类是白猫为59.3%。洗衣粉品类中奥妙在上海、成都、南京、武汉、重庆、杭州及苏州7个城市居渗透率首位，白猫在厦门、深圳、青岛、长春、南宁处于渗透率第一品牌。另一方面，在碗碟洗洁精品类中，在30个城市中有22个城市白猫高居渗透率第一品牌。从同种品牌跨品类的比较来看，白猫在厦门、青岛、南宁4城市、高富力在广州、佛山，立白在海口，洗衣粉与碗碟洗洁精同处于第一品牌地位，白猫在3品牌比较中具有最强的品牌效果。
图6表示的是全国 （30城市）肠胃药主要品牌消费者的性别、年龄、收入比例曲线。从曲线整体变化来看，在性别指标上，丽珠得乐的消费者男性比例高于女性，吗丁啉、三九胃泰则女性比例高于男性。在年龄指标上，丽珠得乐、三九胃泰的消费者25-34岁均都接近30%，而吗丁啉的年龄段则更广一些，其中15-34岁的消费者居于最高水平，约在25%左右的比例。而在收入指标项上，三个品牌的消费者均较集中在收入500-1000元的阶层。在此图表上，可以了解到三个品牌的消费市场部分的相同与不同之处。但是，总体上除性别外，其他指标并没有显著差别。
图7是广州部分媒体以15－34岁，个人月收入500－1000元为目标受众，年龄、收入及平均阅读（收听、收看）率的情况。如图所示的媒体中，在25－34岁的消费群体中，《广州日报》、《家庭医生》、《家庭》、《读者》的阅读率均高于平均阅读率，这个群体也是广东有线翡翠台，广东有线本港台收看比例较高的群体；收入在500－1000元的消费群体则是《家庭》阅读率较高的群体，在电波媒体中，香港亚洲电视本港台，广东电视台－珠江台，广东广播电台珠江影视台、广州人民广播电台一台的25-34岁群体收看比例较高。
篇11
雪鹗拥有一对夜光黄色眼睛，雪白的身体加上优美的飞行身姿让所有人都为之动容，是哈利波特的那只宠物信使猫头鹰的原型。它们主要生活在北极圈地区，非常沉重，雌性平均约为2.3公斤，雄性约1.8公斤，翼展为125到145厘米之间，是北美体型最大的猫头鹰，拥有高度敏锐的视觉、听觉和触觉，可以感应到环境的变化并迅速反应。绝佳的视力以及可以将头转上270度的能力，使之可以毫无困难地猎捕食物。夏天它们一般会南迁到北纬 60 度以北（包括格陵兰，挪威，瑞典，芬兰，加拿大最北部和美国的阿拉斯加）的地区繁衍生息。鸟类爱好者想要亲眼目睹它们的萌模样可不是那么简单的事，但是现在在美国加州家门口或许就会碰到正在打盹的雪鹗。
随处可见的不速之客
野生动物摄影师莉莲・斯托克斯（Lillian Stokes）作为《斯托克斯鸟类指南》系列丛书的作者，认为“当雪鹗赖以生存的鼠类种群崩溃灭绝的时候，这些可爱的生灵也不得不冒险前往南方寻找食物，而今年出现的庞大数量足以说明历史性的时刻即将到来。”在阿拉斯加腹地专门从事雪鹗研究长达22年的丹佛・霍尔特（Denver Holt）说，“2011年的时候入侵的雪鹗规模就已经是全国范围了，有35个州都找寻到了它们的踪迹。”但是以往的经验，大约每隔4年才会出现超乎寻常数量的大爆炸。然而今年，南方的小镇、史密瑟斯、圣詹姆斯堡，伯恩斯湖，库特尼，温哥华岛和内陆低地，甚至南至加利佛尼亚州、德克萨斯州和佛罗里达州都已经成为雪鹗的后花园。
即将被饿死的雪鹗
野生动物学家道格・威尔逊（Doug Wilson）毫不掩饰地说，“今年已然成为历史上数量最为庞大的一年。”然而并不是猫头鹰数量的急剧增长造成的，因为他发现了许多死去的雪鹗尸体。根据这些尸体不难看出，它们都是被饿死的。“因为我看到鸟儿的胸骨上几乎都没有肉，嗉囊里也是空空如也，在目击者观测到的34只雪鹗中有7只已经被饿死。”这些年轻的白猫头鹰或许根本就来不及学习如何捕猎就被迫从原始栖息地迁往数千公里以外的南方，生存环境的变化已经让原本脆弱的生态环境更加雪上加霜。
当深秋来临时，经验丰富的老猫头鹰可以在北极捕猎黄金地区占据地盘，保证自己拥有充足的食物。但是年轻一辈的就只能被迫南下，而且显然这个旅程是一条不归路，许多的猫头鹰都十分虚弱和憔悴，一些观鸟社区组织和动物救助站已经收留了许多这样的鸟儿，为他们人为地提供食物，但是这不是长久之计。动物园和社区可以收留的数量是有限的，观鸟爱好者和爱鸟人士的反对呼声也使得它们重回大自然的计划提上记事日程。
北极旅鼠种群变化
科学家研究发现，归根结底就是北极鼠类种群的突然变化导致食物链顶端的雪鹗无法适应，产生多米诺骨牌似的恶性连锁反应。美国康涅狄格州大学生态学和进化生物学教授及鸟类学家克里斯・埃尔克（Chris Elphick）经过慎密的研究发现，当北极地区啮齿类动物的食物充足情况下，导致雪鹗的种群能够以不同以往的速度繁殖并产生过多的幼年猫头鹰，而且大大提高了幼鸟的存活几率，然而正是这种数量上的泛滥，导致生态平衡被打破；另外，近几年的全球范围的极寒天气是最终的导火索，北美大陆的极寒天不单单出现在北极范围，也在南部的沿海城市出现，这样直接杀死许多旅鼠和田鼠，导致刚刚独立的饥肠辘辘的年轻猫头鹰不得不铤而走险，面对气候异常所带来的麻烦，当然往往都是以生命为代价的。
机场附近的栖息地
经过长途的旅行之后，为什么这些鸟儿会出现在机场？雪鹗是一种喜欢开阔地带的鸟儿，各种不受干扰的海滩、岩石码头、沙丘、沼泽和草原都是它们的最爱。由于天然草地已经让位给经济发展（比如珍贵的高尔夫球场等绿化带），一些仅存的天然栖息地恰好也就位于机场附近，这里的环境和雪鹗生存的环境最为相似，它们也可以找到自己想要的食物资源。但是和其他同样栖息在机场附近的陆地棉鹬、草蜢麻雀、东野云雀和美洲红隼等生物不同的是，雪鹗实在是太大了，对机的危险性毋庸置疑。
篇12
汰渍(Tide)被称做“洗衣奇迹”，自从1946年推出以来，汰渍经过了60多次技术革新及市场开拓。由于采用了新的配方，洗涤效果比当时市场上所有其他产品都好，再加上合理的价格，汰渍现已成为全球最大的洗衣粉品牌之一。
汰渍进入中国市场也已有10年历史，从汰渍第一代到柠檬汰渍再到第三代加强型，短短数年里汰渍经历了几次升级。早在进入中国的第5个年头，汰渍已经成为中国第一洗衣粉品牌。年销售额20亿元左右，是中国洗衣粉市场上的龙头品牌之一。
出生前—严谨的品类规划
夸克(中国)企业顾问有限公司CEO王磊，曾经在宝洁(中国)公司服务了5年，参与了汰渍产品在中国上市及升级规划实施。王磊告诉记者，宝洁的一大特点是，对于任何市场，要么不进入，只要选择进入，就一定要最终占领这个市场。在中国，宝洁早将洗衣粉品类的结构、规划和分阶段实现目标的时间计划得一清二楚，可以说汰渍是在宝洁严谨的品类规划的指导下产生的，因此汰渍先天就有取得成功的优势。
看起来不起眼的洗衣粉，凭借其日常使用量大的特点，在宝洁的销售布局中占据着举足轻重的地位。宝洁公司一直对洗衣粉的期望很高，在很长一段时间里，宝洁的洗衣粉在包括美国本土在内的许多国家的销售额，都占到宝洁公司在当地整体销售额的一半。
在中国，宝洁公司最早推出的洗衣粉其实是定位为高档品牌的碧浪(ARIEL)。碧浪1993年在中国上市时，提出了免搓洗概念，凭借其出色的洗涤效果和高尚的品牌形象，专攻高端用户，销售额很快过亿元。
尽管碧浪利润率相对较高，然而价格因素使其销量受到很大限制。宝洁当时还一口气买下了北京的熊猫、广东的高富力等几个中国本地品牌，这些品牌尽管在各自地区有很大的销量，但并不能给宝洁带来大的利润。
宝洁的计划是，用碧浪满足高端市场，用本地品牌满足低端市场同时占领货架。前者是形象品牌，后者是货架品牌，在这中间宝洁需要有一个真正的利润品牌。这个利润品牌，宝洁选择了汰渍，汰渍被计划成具有较强的功效、合理的成本和价格、良好的品牌形象。
出生—先有概念后有产品
1993年底，宝洁在中国的汰渍品牌小组成立，小组从消费者需求与习惯研究中得到的数据显示，消费者关心的洗衣粉前三个基本功能是日常清洁、去油、衣领、袖口清洁，再通过概念开发座谈会和消费者深度访问后，宝洁确定了两个待选概念：一个是油迹去无痕，另一个是领干净，袖无渍。
在随后的概念测试阶段，由产品研究部开发配方，进行匿名产品测试，通过将品牌总体评价、功能评价、购买意向的测试分数与白猫和活力28比较，得出两个概念皆有上市成功可能的结论。最终品牌小组选择了“去油污”概念。
然而，汰渍在“去油污”概念下销售了一段时间后，发现品牌生长并不理想，概念未能明显胜过竞争对手，真正打动消费者。于是汰渍品牌小组决定，全国推广暂缓，重新选择概念。汰渍再次进行了大量调研发现，领子、袖口是消费者对他人形成印象的一个信号(signal)，而当时并没有别的厂家想到这个概念。因此这次他们选择了“领干净，袖无渍”。这一概念获得了很大成功，宝洁随后推出了柠檬汰渍，来推动销量。
王磊说，要想理解汰渍的营销思路，必须首先知道：与国内许多企业先做产品再找卖点不同，在宝洁，永远是先有概念后有产品。宝洁推出的其实不是一个产品，而是一个概念，一个说法。
宝洁先把汰渍要卖什么、要解决什么问题这些概念决定下来，再交给产品研发部门。产品只是概念的载体，如果调研发现消费者确实需要这个产品，宝洁就去开发这个产品。这就是为什么在某些国家，汰渍定位得比碧浪低档，而在另一些国家，汰渍定位得比碧浪高档。在不同国家，汰渍的定位甚至产品本身都可能不一样，一样的只是“汰渍”这个牌子。
王磊说，这个流程有点儿像日本汽车企业中应用广泛的精益生产模式，其实就是QC(质量控制)的过程，宝洁将营销过程拆成很多个小过程，然后对每个小过程进行QC。每一个过程都有一个明确的质量标准。
成长—消费者需求研究
在汰渍多年畅销的背后，也依靠了宝洁长期监控消费者需要的体系。消费者的需求不是一成不变的，凭借科学的市场研究模型，宝洁持续性对消费者需求进行观察和研究并做出反应。权威统计数据显示，全球市场研究模型中的50%是宝洁发明的。
市场研究模型中最重要的，是关心消费者的需求究竟是什么。宝洁对顾客需求做了很多研究。消费者需求通常分为四个层面，层次越低，需求越具体，第一层需求叫消费者价值需求，例如“我需要适合我的”，然后层次逐渐下降，到了第四层变为利益需求。
但是作为厂商应该关注消费者哪种层次上的需求呢？宝洁认为，人们需要的东西都是现时现刻重要而未能得到满足的需求。这种需要可以作为长期发展产品的信息。汰渍推出三重亮白，就是因为这是消费者当前最重要的需求。对洗衣粉这种使用性强的产品来说，消费者的价值需求这种精神层面的东西并不为宝洁所看重。
所以正如我们看到的那样，汰渍一贯宣传洗衣效果，而不多在价值层面上做的文章。然而，就在很多曾经辉煌的洗衣粉品牌如活力28、白猫被汰渍击垮之后，汰渍却被雕牌打了个措手不及。雕牌“只买对的，不买贵的”这一口号，以及下岗女工的故事，从精神层面打动了消费者。因为宝洁着重以利益为基础的宣传，而雕牌宣传则以价值为基础，雕牌正是在价值需求层面上突破了宝洁，尽管这跟产品本身没有关系。
由此可见，消费者受到社会文化的影响，价值理念不光存在，而且已蔓延到生活的各个领域，但事实又证明，宝洁从管理上将汰渍定位为一个利益需求为基础的品牌是正确的。尽管在短期内雕牌给了汰渍很大的压力，但最终对洗衣粉来说，消费者看重的还是产品，洗干净和洗白是最重要的。这就是为什么后来汰渍一降价，便大量收复失地的原因。
宝洁已经形成了自己的标准体系，将对消费者的持续研究应用在产品升级上。宝洁采用管道式新产品开发模式，螺旋形地进行产品升级。一个产品一上市，其升级产品就开始研究了，等这个产品在市场上成长到一定阶段，新产品就出来了。可以说，宝洁对消费者的研究从来就没有停止过，这种升级无休无止，像螺旋一样不断往前走。宝洁知道，一个产品好卖不等于就能卖千秋万代。要做好品牌，只有螺旋形前进才能保证，因为今天再新的东西，到了明天可能就很普通了，与其等着那天到来，还不如主动去否定和推翻自己。
链接：
宝洁量化的工作流程:
一、前期概念的筛选过程：
访谈
开座谈会
拿出概念原型
量化的调研测试
设计多个不同概念让消费者进行评价
预测消费者的购买情况
